响应面法优化黑皮鸡枞总黄酮提取工艺

序论：速发表网结合其深厚的文秘经验，特别为您筛选了1篇响应面法优化黑皮鸡枞总黄酮提取工艺范文。如果您需要更多原创资料，欢迎随时与我们的客服老师联系，希望您能从中汲取灵感和知识！

黑皮鸡枞（Ｏｕｄｅｍａｎｓｉｅｌｌａｒａｐｈａｎｉｐｅｓ）又名卵孢小奥德蘑、长根菇，是一种适合工厂化栽培的高端珍稀食用菌［１－４］。黑皮鸡枞香味浓郁、口感鲜嫩，不仅富含人体所需的蛋白质、脂肪、氨基酸，还含有多糖［５－７］、黄酮［８］等多种活性成分，而且具有极高的食用和药用价值。目前，黑皮鸡枞主要是以鲜品食用为主，包括炒菜、煲汤等，其子实体含有多种鲜味氨基酸、５′－核苷酸，具有成为天然健康型调味品原料的潜能［９］。黄酮类化合物广泛存在于各种食用菌中，具有抑菌、抗氧化、预防骨质疏松、抗过敏等功效［１０－１３］，因而受到研究者及健康产品开发人员的广泛关注。然而，目前关于黑皮鸡枞中黄酮的提取工艺研究较少且提取效率较低。基于此，本试验拟采用单因素试验和响应面法进行工艺优化，利用超声波辅助乙醇法探索从黑皮鸡枞中提取总黄酮的工艺条件，以期获得一种操作简单、提取率高的总黄酮提取工艺，为黑皮鸡枞总黄酮的开发利用提供研究基础。

１材料与方法

１．１材料与仪器

黑皮鸡枞子实体：中国农业科学院都市农业研究所栽培基地；芦丁：北京索莱宝科技有限公司；无水乙醇：成都市科隆化学品有限公司；亚硝酸钠、氢氧化钠、九水硝酸铝：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。ＷＰ－ＵＰ－ＬＨ－２０Ｓ理化分析型超纯水机四川沃特尔水处理设备有限公司；ＷＧＬＬ－１２５ＢＥ电热鼓风干燥箱、ＦＷ１７７中草药粉碎机天津市泰斯特仪器有限公司；ＴＸ３２３Ｌ电子天平岛津菲律宾制造有限公司；ＦｌｅｘＡ－２００酶标仪杭州奥盛仪器有限公司；ＳＢ２５－１２ＤＴＤ超声波清洗机宁波新芝生物科技股份有限公司。

１．２试验方法

１．２．１黄酮提取工艺黑皮鸡枞子实体→烘干→粉碎→过筛（４０目筛）→黑皮鸡枞粉末→称量→加入提取溶剂→超声辅助提取→过滤→定容→测定黄酮。１．２．２黄酮标准曲线的制作以芦丁作为标准品，参考孙琼［１４］的方法进行黄酮的测定。以芦丁对照品溶液的质量浓度（μｇ／ｍＬ）为横坐标、吸光度（ＯＤ）值为纵坐标，得标准曲线方程ｙ＝０．００１６ｘ－０．００３１，相关系数Ｒ２＝０．９９２９。１．２．３黑皮鸡枞总黄酮含量的测定准确称取１．００ｇ黑皮鸡枞粉末，在一定体积、浓度的乙醇溶液基础上，添加一定料液比的蒸馏水。通过功率３００Ｗ的超声波处理，按照不同的超声时间、超声温度提取黑皮鸡枞总黄酮，过滤后收集提取液，定容至５０ｍＬ，摇匀，每组试验重复３次。移取２μＬ溶液至９６孔板中，按照孙琼的方法测定其吸光度，计算黑皮鸡枞总黄酮的提取率，公式如下：Ｗ＝Ｃ×Ｖ／１０００ｍ×１００％。式中：Ｗ为黑皮鸡枞菌总黄酮提取率（ｍｇ／ｇ）；Ｃ为提取液中总黄酮的质量浓度（μｇ／ｍＬ）；Ｖ为供试总黄酮样品液体积（ｍＬ）；ｍ为黑皮鸡枞粉末质量（ｇ）。１．２．４单因素试验在１．２．１的提取工艺下，准确称取黑皮鸡枞粉末１．００ｇ，将黑皮鸡枞总黄酮提取率作为指标，通过单因素试验探究乙醇浓度（５０％、６０％、７０％、８０％、９０％）、液料比（２０∶１、３０∶１、４０∶１、５０∶１、６０∶１）、超声时间（３０，６０，９０，１２０，１５０ｍｉｎ）、超声温度（４０，５０，６０，７０，８０℃）４个因素对黑皮鸡枞菌总黄酮提取率的影响，并筛选出各因素的最适范围，为响应面法优化试验做好水平选取，每组试验重复３次。１．２．５黑皮鸡枞总黄酮提取工艺优化采用ＤｅｓｉｇｎＥｘｐｅｒｔ８．０．６．１软件，在单因素试验基础上，采用四因素三水平响应面试验，对黑皮鸡枞总黄酮的提取率进行响应面设计，因素水平见表１。１．３数据处理每组试验处理重复３次，结果用平均值±标准差表示，采用Ｅｘｃｅｌ２０２０、ＤｅｓｉｇｎＥｘｐｅｒｔ８．０．６．１和ＳＰＳＳ进行数据统计和分析。

２结果与分析

２．１单因素试验结果

２．１．１不同乙醇浓度对黑皮鸡枞总黄酮提取率的影响由图１可知，为探究不同乙醇浓度对黑皮鸡枞总黄酮提取率的影响，选择５０％～９０％乙醇浓度进行试验。乙醇浓度从７０％增加到８０％时，提取率显著提高，从２．２８ｍｇ／ｇ提高到３．６９ｍｇ／ｇ，可能是由于黑皮鸡枞总黄酮的极性与乙醇极性接近［１５］。但当乙醇浓度超过８０％时，黑皮鸡枞总黄酮提取率呈现降低趋势，可能是因为黑皮鸡枞中其他醇溶性杂质浸出的比例升高，降低了黄酮的溶解［１６］。因此，选择乙醇浓度为８０％。２．１．２不同液料比对黑皮鸡枞总黄酮提取率的影响由图４可知，超声温度对黑皮鸡枞总黄酮提取率的影响较为明显。当超声温度在４０～７０℃范围内时，由于超声温度显著增加，小分子间流动加快，有利于黑皮鸡枞总黄酮的溶出。当超声温度在７０～８０℃范围内时，黑皮鸡枞的总黄酮溶出急剧减少。这可能是由于乙醇本身易挥发，温度过高，黑皮鸡枞总黄酮发生氧化分解，同时乙醇浓度加速降低，导致提取率陡然下降［２０］。因此，选择超声温度为７０℃。

２．２黑皮鸡枞菌总黄酮提取响应面试验

２．２．１响应面试验设计与结果以总黄酮提取率为响应值，使用ＤｅｓｉｇｎＥｘｐｅｒｔ８．０．６．１软件进行Ｂｏｘ－Ｂｅｈｎｋｅｎ试验设计，结果见表２。根据ＤｅｓｉｇｎＥｘｐｅｒｔ８．０．６．１软件对表２中数据进行回归分析。通过ＤｅｓｉｇｎＥｘｐｅｒｔ８．０．６．１软件进行方差分析，结果见表３。注：“＊”代表差异显著（Ｐ＜０．０５）；“＊＊”代表差异极显著（Ｐ＜０．０１）；“＊＊＊”代表差异高度显著（Ｐ＜０．００１）。由表３可知，模型的Ｐ值＜０．０００１，表明模型显著。失拟项的Ｐ值＝０．０５５０＞０．０５（不显著），说明该模型误差小。Ｒ２＝０．９０７０，ＲＡｄｊ２＝０．８１４１，说明模型拟合度较高，有１８．５９％的情况该模型无法解释［２１－２３］。其中Ａ、Ａ２、Ｂ２、Ｃ２高度显著地影响黑皮鸡枞总黄酮提取率（Ｐ＜０．０００１）；Ｂ极显著地影响黑皮鸡枞总黄酮提取率（Ｐ＜０．０１）；Ｄ２显著地影响黑皮鸡枞总黄酮提取率（Ｐ＜０．０５）；其余因素对黑皮鸡枞总黄酮提取率的影响不显著。根据Ｆ值与Ｐ值的大小分析，试验范围内各因素对总黄酮提取率的影响大小为Ａ（乙醇浓度）＞Ｂ（液料比）＞Ｃ（超声时间）＞Ｄ（超声温度）。２．２．３响应面分析为考察各因素交互作用对黑皮鸡枞总黄酮提取率的影响，采用ＤｅｓｉｇｎＥｘｐｅｒｔ８．０．６．１软件绘制响应面图，见图５。响应面平面图中，若等高线为圆形，则两因素之间的交互作用较弱；若等高线为椭圆形，则两因素之间的交互作用较强［２４］。由图５可知，黑皮鸡枞总黄酮提取率的优化工艺条件中各因素等高线趋于圆形，结合模型方差分析结果，各因素的交互作用相对较弱（Ｐ＞０．０５）［２５］。２．２．４验证试验根据上述分析，发现各因素间的响应面和等高线与回归方程分析结果吻合，根据ＤｅｓｉｇｎＥｘｐｅｒｔ软件预测的结果，得到黑皮鸡枞总黄酮最优提取参数。结果显示：乙醇浓度８２．３０％、液料比４２．４４∶１、超声时间１１６．６８ｍｉｎ、超声温度７０．１５℃时，黑皮鸡枞总黄酮提取率预测值为４．９１７６７ｍｇ／ｇ。结合理论预测和实际应用，优化结果表明，以８２％乙醇为溶剂，４２∶１（ｍＬ／ｇ）液料比处理１１７ｍｉｎ，超声辅助提取总黄酮，重复３次试验，黑皮鸡枞总黄酮提取率平均值为４．８９ｍｇ／ｇ。利用选定的最优条件检验模型方程预测最优响应值的适用性，结果吻合度较高，表明该优化工艺具有稳定性和可行性。

３结论

本研究采用超声辅助乙醇法，以最大限度地提高黑皮鸡枞中总黄酮的提取率。通过Ｂｏｘ－Ｂｅｈｎｋｅｎ响应面设计，对乙醇浓度、液料比、超声时间和超声温度４个参数进行了优化，得到最佳提取条件：乙醇浓度８２％，液料比４２∶１（ｍＬ／ｇ），超声时间１１７ｍｉｎ，超声温度７０℃。此条件下黑皮鸡枞总黄酮提取率达到４．８９ｍｇ／ｇ。该方法的黄酮提取量高且方法简单，为黑皮鸡枞黄酮在食药用品、功能性调味品方面的应用奠定了基础，提高了黑皮鸡枞的附加价值。

作者:张晨 赵金 严俊杰 苗人云 林俊彬 李翔 周向荣 张攀 甘炳成 单位:中国农业科学院都市农业研究所 成都大学 食品与生物工程学院 成都农业科技中心 金堂县现代农业装备产业园管理委员会 四川田岭涧生物科技发展有限公司