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二、折旧额的核算方法
（一）固定资产磨损价值贬值的量变规律。
为了正确地核算折旧额，即在通货膨胀条件下，能抵补货币贬值的损失，在固定资产寿命期各个时间阶段上所计算的折旧额之和，能够满足从使用价值上恢复原有固定资产规模的需要，这首先就需要分析固定资产磨损价值贬值的量变规律。
固定资产是长期使用的物质资料，而生产性的固定资产是物质产品生产过程中的劳动资料。因而，固定资产再生产的过程是：
购置建造一交付使用一报废一再购置建造。
从上述过程可以看出：建（购）置是固定资产原始价值的始点，报废是固定资产原始价值的终点。在寿命期中，固定资产每年在提取折旧后，其金额必要产生一个无形贬值量。这个贬值量的变化过程可用公式表示如下：
式中：Z代表固定资产原值；Z’代表货币贬值的损失量；Y代表年折旧额；L代表物价上涨率；l，2…n代表时序；n代表固定资产使用年限。
在通货膨胀条件下，为了避免固定资产贬值的损失，在核算折；日时，应当把贬值（Z’）加到折旧额中，进入产品成本，待产品出售后，收回折旧以满足更新固定资产的需要。
（二）核算折旧的公式设想。
上面从递减折旧的观点，考察固定资产逐年递减的贬值量的变化规律的，但为了正确计算年折旧额，可以从另外一个角度观察这个问题，即一方面以整个固定资产原值为基数，随着时间的推移，由于通货膨胀，货币贬值，可把逐年贬值量加到固定资产原值中去，使固定资产从其生命的始点到生命的终点，仍能保值。另一方面每年提取的折旧额，从第～年末开始，直至折旧终止为止亦逐年加进一个贬值额，并假定固定资产在报废时无残值，则可建立如下公式：
把上述方程作为如下整理，则：
整理后简得：
现仍以本文前面购买10辆汽车为例：
Z=100万元，n=10年
则该批汽车的年折旧额为：
计算结果，每年提取13．8909万元，在10年物价总水平上升87．186%的条件下，在10年后仍然能够购买载重量为4吨的10辆载重汽车。然而按传统的方法计算折旧，即100万元10年=10万元，在通货膨胀条件下，所计算的折旧总额，是无法按照原有固定资产使用价值规模更新全部固定资产，即无法保证固定资产保值的。
三、核算折旧额的几个具体问题
通过实例证明，笔者认为上面所设计并经过推导，论证所建立的在通货膨胀条件下，计算折旧额的公式是科学的，但在应用公式时，仍有下列问题需做进一步的研究。
（一）价格指数的选择。
通货膨胀，物价上涨，这是一个普遍的问题。但在现实经济生活中，由于各种商品在国计民生中的作用不同，因而其物价上涨幅度是不相同的。因此，在我国实际工作中编制有各种性质的价格指数。那么在计算固定资产折旧额时，应当采用哪种价格指数为宜呢？笔者认为，应当采用国家统计局编制的固定资产投资价格指数。这一指数综合反映我国固定资产投资价格的变动程度，而且与折旧额的联系最为密切。
（二）固定资产贬值率总额。
固定资产折旧的计算是一个十分重要经济问题，它关系到正确评价企业经济效益与国家财政收入等问题。因此国家财政部门应当根据固定资产投资价格总指数与分类指数，考虑到未来一段时期内经济发展的趋势，对价格变动作出预测，并以定额参数的形式公布，供各企业计算折旧时采用。当然我们不否认制定定额参数即货币贬值的定额参数是十分复杂的工作。但为了保证这项工作的准确性与科学性，可以在预测的基础上经有关专家讨论，尔后经有关权威机构批准，再行公布采用。
（三）定额贬值率与实际贬值率的问题。
货币定额贬值率与实际贬值率是要发生离差的，因此，根据定额货币贬值率计算的折旧额和实际货币贬值率计算的数值之间，必须要产生一个差数，为此需要调整。一般来讲，在年度执行过程中，可按货币定额贬值率计算，待年终决算时，再根据实际货币贬值率进行调整，其公式如下：
YI=Y[l＋（L1－L）]
式中：YI代表调整后的折旧额；Y代表按货币定额或预计贬值率折旧额；LI代表实际货币贬值率；L代表定额货币贬值率。
治疗
本病属于免疫系统疾病，治疗该病症必须增强免疫力，可以注射"免疫抑制剂"治疗。
2护理
护理计划及早制定。患儿所患一种罕见的疾病，尽快确诊，积极配合医生迅速和有效地使所有援助检查，皮肤科，儿科和其他科室会诊。对这种严重的疾病评估，获取相关信息，并与医生的治疗方案，孩子们组织讨论，制定了详细的护理计划，认真落实和不断改进的条件，并根据合理的谨慎措施转变。
2.1发烧护理 密切观察体温变化，每天6次测量体温恢复正常后3天，每天一次衡量，卧床休息，补充营养和液体的温度后，及时更换汗湿衣服，以防止滴湿疹的发生。
2.2心理护理 儿童有康复的强烈愿望，通过耐心说服，消除恐惧的治疗，治疗可以有意识地给予精神上安慰。为家长密切合作进行治疗。
2.3 高蛋白饮食和营养，高维生素，好食物和合理的原则，以改善机体健康。增加人体的耐受化疗，提高免疫力。特殊治疗时，如呕吐，严重且难以考虑饮食或静脉高营养消耗的元素，以确保病人有足够的热量，改善营养状况。
2.4病人的病情在手术前仔细观察，观察腹部疼痛，位置，范围，腹胀情况排气排便情况的性质，使快速，皮肤准备，术前皮肤测试等，禁用止痛药，以防掩盖病情。
2.5 患者手术后回到病房，以枕平卧4〜6小时，头侧面，保持呼吸通畅，必要时给予吸氧。麻醉前作出明确，监测有无呕吐，腹胀，排气排便情况，保持引流通畅胃肠减压生命体征及腹部症状密切观察，并观察引流液，颜色和数量的性质;禁止在食品，良好的口腔护理，根据医生的意见合理补充水分和电解质溶液;术后早期的半卧位，鼓励早期活动，防止肠粘连，这将有利于身体恢复;蠕动恢复。适当的饮食应少量多餐，逐渐结束，并观察是否进食后腹痛，腹胀，呕吐等症状，如果上述症状，应暂停进食，看看是否有肠梗阻，吻合口狭窄等并发症;该观察伤口无出血，渗液，肿胀，保持伤口敷料清洁干燥，防止尿液污染伤口。
2.6药物不良反应及护理 对化疗药物的胃肠道不良反应的各种观测是普遍的。在化疗前或口服止吐药物化疗期间的饮食，以减少恶心和呕吐，静脉注射30分钟要轻和消化。做三查七对的。（1）长春新碱导致末梢神经炎，皮肤，肌肉和关节四肢麻木，疼痛，腹痛，肝，肾功能表现应该是保护，注意血液中的变化，低白血细胞分离应该很好对各种感染的保护;（2）高剂量甲氨蝶呤结合6 - MP的时间。使胃肠道反应，口腔炎，口腔溃疡恶化。重要的骨髓抑制，国会议员在6个半小时，晚饭后口服，每日一次，以减轻反应，同时加强口腔护理，甲氨蝶呤输液，可能含有冰或冷水，以减少口腔黏膜和菜，氨浓度的甲氨蝶呤（3）VP16的使用，应密切观察有无泄漏，一旦发现，应立即停止输液，以避免组织坏死和（或）血酸静脉炎。 16输液的副总裁会引起性低血压，它会促使孩子说谎，缓慢的速度静脉滴注。
1 材料和方法
1.1 临床样本收集
种植体周围炎的骨组织样本来自中国总医院种植科，选取患者年龄小于等于60岁、种植体植入年限小于等于3年、种植于磨牙区且因种植体周围炎出现种植体脱落的患者4例，刮取种植体附着以及种植窝中的骨组织。正常组织来源的样本来自中国总医院口腔外科，选取4例身体健康的相同年龄段的第三磨牙拔除术患者，夹取舌侧骨板。所有患者均排除牙周炎，且近期没有急性感染、糖尿病、家族遗传病和骨质疏松症等全身系统性疾病。本研究已经中国总医院伦理委员会批准，且每例患者均签署了知情同意书。
1.2 成骨细胞的分离培养与纯化
PBS反复冲洗5次组织块，将较大的组织块剪为1 mm3大小，转移至离心管中，加入含有13.7 g·L-1 Ⅳ型胶原酶（北京索莱宝科技有限公司）和5 g·L-1胰蛋白酶（Amresco公司，美国）的消化液，37 ℃震荡消化45 min。1 000 r·min-1离心8 min，去上清，加入H-DMEM培养液（GIBCO公司，美国）和10%胎牛血清（Invitrogen公司，美国），吸管反复吹打成细胞悬液，接种培养皿中，置于37 ℃、5%CO2孵箱内培养。24 h后观察细胞贴壁及生长情况，待铺皿80%进行传代。采用反复贴壁法[3]对细胞进行纯化。
1.3 碱性磷酸酶鉴定染色
将第3代分离纯化后的成骨细胞以每孔1×104个的密度接种于24孔板，细胞达70%时，用4%多聚甲醛在4 ℃固定30 min。PBS反复冲洗后，使用碱性磷酸酶试剂盒（Sigma公司，美国）染色1 h。PBS反复冲洗后，在倒置相差显微镜下进行常规观察及照相。
1.4 MTT法检测成骨细胞的增殖能力
取对数生长期第3代细胞，经胰蛋白酶消化后离心加入DMEM（10%胎牛血清）终止成细胞混悬液，调整密度为2×104个·mL-1接种于96孔板，每孔0.2 mL。贴壁后隔天换液，连续培养8 d。每隔24 h取3孔，每孔加入20 μL 5 g·L-1 MTT溶液，37 ℃、5%
CO2[专业提供写作论文和论文写作服务，欢迎您的光临dylw.net]孵箱中孵育4 h，加入二甲基亚砜200 μL。采用酶联免疫检测仪490 nm波长下检测吸光度值，实验重复3次。
1.6 Western blot法检测成骨细胞相关蛋白OCN的表达
取第3代细胞进行接种，培养7 d后，将细胞用0.01 mol·L-1 PBS反复冲洗3遍，裂解细胞提取蛋白。取等量蛋白经8%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳后，将凝胶转移到聚偏二氟乙烯膜上，脱脂奶粉封闭过夜。加入鼠抗人OCN（Abcam公司，英国）（1︰1 000稀释）和β-actin（1︰2 000稀释），37 ℃孵育2 h，洗膜后，经辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG2a（Abcam公司，英国）（1︰4 000稀释）孵育50 min，化学发光法显示抗原抗体复合物，X线片显影并定影，所有杂交信号经成像分析仪系统测定条带密度进行定量分析，以目的蛋白灰度值与内参β-actin的比值表示蛋白的表达水平。
1.7 统计学分析
采用SPSS 13.0软件进行统计分析，独立样本t检验进行两组间比较，P<0.05为有统计学差异。
2 结果
2.1 成骨细胞的分离培养及纯化
种植体周围炎来源的成骨细胞与正常组织来源的成骨细胞在培养过程中状态基本相同，10～14 d时从组织块中爬出，形状多为不规则形和三角形（图1）。反复贴壁法纯化成骨细胞贴壁后，2种来源的细胞在形态学上无明显差异，细胞均呈长梭形和多边形，胞核可见多核仁，呈圆形或椭圆形（图2）。
2.2 碱性磷酸酶鉴定染色
细胞固定后按碱性磷酸酶活性检测试剂盒要求进行检测，可见蓝黑色颗粒沉积在胞浆碱性磷酸酶活性部位（图3）。2种来源细胞都表现出了碱性磷酸酶阳性，但正常组织来源的成骨细胞比种植体周围炎来源成骨细胞内可见更多染色颗粒。
2.3 2种来源的成骨细胞增殖能力的比较
MTT检测结果（图4）表明，正常组织来源与种植体周围炎来源的成骨细胞都表现出了一定的体外扩增能力，从第4天起2种来源细胞的增殖能力出现统计学差异（P<0.05），种植体周围炎来源的成骨细胞的增殖活力明显低于正常组织来源的成骨细胞。
2.5 2种来源的成骨细胞相关蛋白的比较
Western blot检测结果表明，培养7 d时，与正常组织来源的成骨细胞相比，种植体周围炎来源的成骨细胞OCN的表达降低，相对灰度值分析表明种植体周围炎来源的成骨细胞OCN的表达水平约为正常组织来源的1/3（P<0.05）（图6）。
3 讨论
骨结合是牙种植手术的基础。种植体与颌骨骨性结合面的形成与种植区的骨密度密切相关，骨密度越高，种植体与骨的结合率就越高[4]。种植体周围炎正是在炎性微环境下，破坏了种植体与颌骨的骨结合，从而使种植体周围支撑骨组织的功能丧失。成骨细胞在骨组织的修复和改建中起到重要作用，是维持骨组织新陈代谢[专业提供写作论文和论文写作服务，欢迎您的光临dylw.net]的主要细胞；因此，研究炎症组织来源的成骨细胞很有意义。
本研究从种植体周围炎种植体脱落患者的颌骨骨组织中分离培养获得了炎症组织来源的成骨细胞，通过比较炎症组织来源的成骨细胞和正常组织来源的成骨细胞的增殖能力以及相关骨组织修复基因的表达等生物学功能变化，探讨炎性微环境对成骨细胞生物学功能的影响。
本实验选用的成骨细胞均为第4代以内的细胞，结果表明，炎症组织来源的细胞在体外培养后仍然具有一定的炎症组织来源特异性。炎性细胞因子和种植体周围炎致病菌的毒力因子会导致成骨细胞的增殖能力显著 下降。本研究结果显示，种植体周围炎来源的成骨细胞虽然在形态学上并没有表现出和正常组织来源的成骨细胞有明显差异，但是在细胞增殖活力方面表现出了不同，种植体周围炎来源的成骨细胞的增殖活力整体低于正常组织来源的成骨细胞。笔者认为这是由于种植体周围炎的炎性微环境抑制了成骨细胞的增殖能力。
Runx2和Col Ⅰ是反应成骨细胞分化能力的重要指标，Runx2是成骨细胞分化的关键转录因子，在骨组织的形成与重建过程中具有重要的作用[5]。炎性因子会影响Runx2的表达从而抑制成骨细胞的分化能力[6-7]。Col Ⅰ是成骨细胞分化成骨的重要基质。研究[8]表明，种植体周围炎的龈沟液中Col Ⅰ水平下降。本研究结果显示，种植体周围炎来源的成骨细胞的Runx2和Col Ⅰ表达水平相比正常组织来源显著下降，表明炎性微环境可影响成骨细胞的成骨分化能力，抑制Runx2和Col Ⅰ的正常表达，这与Liu等[9]对干细胞的研究结果一致。
OCN与成骨细胞的矿化紧密相关，在一定程度上反应了成骨细胞矿化的能力。学者[10]研究证实炎性微环境会降低[专业提供写作论文和论文写作服务，欢迎您的光临dylw.net]OCN的表达。本研究中，种植体周围炎来源的成骨细胞由于在炎性微环境下降低了OCN mRNA的表达，从而导致OCN蛋白水平也明显降低。可见炎性微环境抑制了成骨细胞矿化的能力。
人非小细胞肺癌NC-H446细胞株由中国医科大学细胞室提供，我院实验中心细胞室保存。
1.3 主要仪器
美国SHELLAB2300型CO2细胞培养箱；日本Nikon倒置相差显微镜；美国Sfat自动酶标分析仪；美国FACScan流式细胞仪等。
1.4 实验方法
1.4.1 肺康饮含药血清的制备
1.4.3 细胞培养
1.4.4 肺康饮含药血清对NC-H446细胞增殖的影响
抑制率（%）=（1- OD实验组/ OD对照组）×100%
1.4.5 肺康饮含药血清诱导肺癌细胞凋亡表达的测定
1.5 统计学方法
采用多因素方差分析法检测组间差异的显著性。所有统计学检验均应用SPSS11.5统计软件进行。
2 结果
2.1 肺康饮含药血清对NC-H446细胞增殖的影响
2.2 肺康饮含药血清对NC-H446细胞凋亡的影响
3 讨论
1治疗现况
中医对本病的病机尚未有一个统一的标准，临床治疗多辨证使用益气活血，养阴清热，健脾祛湿，温经通络，补益肝肾，温阳散寒，活血化瘀，或配合中药外洗外敷等方法，多数医家认为瘀血内阻是本病的基本因素。因此，活血化瘀应贯穿疾病始终，临床上也多以活血化瘀方剂为主，疗效确定。西医治疗方法主要有药物治疗、手术治疗、介入治疗。药物治疗包括抗栓和扩张血管治疗，积极的治疗高血压、高血脂，防治动脉硬化，稳定斑块，防止斑块破裂。手术治疗主要指重建肢体血运，包括动脉内膜剥脱术、血管旁路移植术和血管腔内治疗术；ASO的介入治疗仍局限于短段病变，短段主髂动脉病变的球囊扩张和支架置入术效果较好；此外，随着狭窄的逐渐形成，肢体的侧支循环随之逐渐建立[3]，使得一些医家逐渐注意到利用血管内皮细胞生长因子等诱导血管生成的基因治疗。
2补肾与动脉硬化性闭塞症关系
动脉硬化性闭塞症多见于中老年患者，人到中年以后，肾中精气逐渐减少，出现肾虚。肾阴虚则脏腑百脉、形体器官失充，血液凝涩，脉络失养，则患者表现为肢端色黑坏死破溃，剧痛，夜不能眠，肢端潮红或暗红，肢体肌肉明显萎缩，皮肤干皱、口渴、便秘、溲赤，发热；肾阳虚则阳气亏虚无力推动、温煦气血以荣四末，致血行迟缓不畅而瘀，则指（趾）端坏疽或溃疡、四肢发凉，患处皮肤温度较低，肤色苍白，脉搏减弱或消失等。笔者认为肾虚是造成本病血脉闭塞的关键环节，在治疗本病中补肾也起着关键的作用，鹿茸性甘、咸、温，归肝、肾经，具有补肾阳、益精血、强筋骨、调冲任、托疮毒之功效，鹿茸对动脉硬化闭塞症的防治作用主要有以下几点。
2.1鹿茸可促进血液生成和血行中医认为，鹿茸可使人体肾精充盛，防止衰老，壮肾阳，肾阳可促进机体的温煦、运动兴奋和化气功能，使气的运动加快，则血的输布运行也加快，气化加快则产热增加，使温煦作用加强，使阳虚患者患肢血脉得到温养而减轻病情。鹿茸还可益精血，强筋骨，为血肉有情之品，使动脉硬化性闭塞症患者患肢血液充足，血脉得到濡养，有助血行。李召[4]研究发现鹿茸对正常及白血病骨髓与人骨髓单个核细胞有促增殖作用，能促进骨髓造血，而且鹿茸有抑制红细胞凝集和促进纤维蛋白溶解的作用[5]。
2.2鹿茸可促进血管新生鹿茸在治疗动脉硬化性闭塞证中还和促进血管新生有关，研究发现温阳药物鹿茸能促进人骨髓间质干细胞的增殖活性，而骨髓是一个天然的细胞生长因子库，在其生长过程中，成骨细胞、神经细胞、成纤维细胞及上皮细胞的生长同步进行[6]，血管内皮细胞的祖细胞（endothelialprogenitorcells，EPCs）主要存在于骨髓。何秀娟等[7]发现鹿茸能促进离体人脐静脉内皮细胞的增殖，提示在体内可能促进EPCs的增殖，促进血管生成。血管内皮祖细胞是成年个体中与血管新生关系最为紧密的干细胞成分，是血管内皮细胞的前体细胞，EPCs的增殖、趋化、分化，参与新生血管的形成，它可以被细胞因子或者来自于外周血中的血管生长因子信号动员到外周循环而进入外周血管组织中，通过整合到血管壁或提供生长因子两种方式来促使新生血管的形成[8]，新生的血管为缺血部位提供氧、营养物质和生物活性物质，进一步促进缺血部位血管新生，改善缺血状态。中医认为肾主骨生髓，骨者，髓之府，因此，补肾可生髓，从这点也提示了鹿茸可以促进骨髓增殖。血液中的内皮祖细胞对组织缺血有反应，人外周血中培养扩增的EPCs，在肢体缺血的动物体内，能够特异性地向缺血部位趋化，参与血管生成，增加毛细血管数量，具有改善组织血流的治疗作用。向缺血部位趋化的具体机制还不清楚，可能与缺血所造成的局部低氧血症、缺血组织释放的某些细胞因子和炎性因子，对这些细胞的趋化可能发挥了一定作用[9]。
2.3鹿茸可促进疮口愈合中医认为鹿茸有托疮毒之效，可用于疮疡久溃不敛，或阴疽内陷不起，可温补精血，托毒外出和生肌之效，对于动脉硬化闭塞症后期出现的破溃反复难愈有托毒和生肌之功，可促进疮口愈合。现代医学发现，马鹿茸多肽通过促进表皮细胞和成纤维细胞增殖加速皮肤创伤愈合[10]。
3小结
鹿茸性甘、咸、温，归肝、肾经，具有补肾阳、益精血、强筋骨之功效，可用于肾阳不足、精血亏虚、筋骨无力之症，为补肾之良药。这从传统理论方面提示了鹿茸具有促造血，缓解肢体不适之功效，笔者在临床中也遇到此病患者甚多，常给予芪芍复脉汤[鹿茸2g（研末冲服），黄芪30g，白芍18g，桂枝10g，当归15g，麦冬15g，玄参15g，川芎10g，全蝎10g，川牛膝15g，土元10g，乌药10g，丹参30g，三七粉3g，阿胶6g，甘草6g]，随症辨证加减，意在用芪芍复脉汤益气活血，滋阴复脉，加鹿茸意在温补肾阳，又补益精血，强筋骨，恢复阳气温煦推动之力，使精血充盛，临床应用，效果显著，而且许多患者在病情好转的同时病变部位血管彩超发现新生血管且血流通畅。
现代研究认为鹿茸多肽既对表皮细胞和成纤维细胞具有显著的促进增殖作用，加速创面愈合的质量和速度，又可促进血液运行，促进血管内皮细胞的增殖分化和迁移，促进病变部位血管生成，这些都表明鹿茸对动脉硬化性闭塞症的防治有着积极的作用，加之中医认为鹿茸乃血肉有情之品，可以补肾填精，由以上可以推断，鹿茸骨髓EPCs促进血管新生，鹿茸是否还具有把EPCs动员到外周缺血组织的作用，是否需要益气活血类药物来促进它的转移，这些还有待进一步的实验及临床观察，但这一发现对缺血性疾病的治疗提供了一个新思路。董蔚等[9]在体外扩增EPCs的基础上，进一步观察了EPCs在动物体内促血管生成的作用，EPCs可特异性地分布在缺血肢体的血管结构中，缺血部位的侧支循环形成和毛细血管新生可能与外源性血管生长因子、基因或内皮祖细胞转入组织中有关，我们可以发现和利用一些药物或生长因子促进EPCs表达、促进EPCs从骨髓向外周动员，提高循环中的血管内皮祖细胞的数量，或通过移植体外扩增的EPCs来增强缺血组织的血管再生，从而促进新生血管的形成。鹿茸在治疗动脉硬化性闭塞症中起着重要的作用，随着对其作用机制的深入研究，很有可能寻找到治疗ASO的有效途径。
参考文献：
[1]吴庆华.下肢动脉硬化闭塞症的诊治进展[J].继续医学教育，2007，20（9）：98101.
[2]赵钢，吕勃川，孙秋.动脉硬化闭塞症的治疗体会[D].中华中医药学会周围血管病分会第二届学术大会论文集，2009.
[3]刘昌伟.下肢动脉硬化闭塞症的外科治疗[J].血管外科，2006，7（2）：13.
[4]李召.鹿茸组分对人骨髓造血细胞体外增殖影响的研究[D].大连医科大学学位论文，2006.
[5]久保道德.梅花鹿茸和马鹿茸的乙醇浸提物对血流动力学的影响[J].特产研究，1997（4）：4.
[6]崔昊震，尹明浩.鹿茸生长因子的研究现状[J].延边大学医学学报，2006，29（l）：7072.
[7]何秀娟，李萍，邱全瑛，等.几种外用中药成份对离体人脐静脉内皮细胞增殖的影响[J].中国病理生理杂志，2004，20（5）：832835.
【正文快照】：
石墨烯(Graphene)是一类单原子层二维原子晶体,于2004年首次从石墨中分离获得[1],其丰富而优异的电学、力学和热学性能[2]使其成为近年来纳米材料领域的研究热点。氧化石墨烯(Grapheneoxide,GO)是生物医学领域应用较多的石墨烯衍生物之一,运用Hummer方法[3],由石墨经化学氧化
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1 冯翠霞;张艳;林丽玲;张彩虹;陈剑刚;;高效液相色谱法测定尿中马尿酸、甲基马尿酸三种同分异构体[J];广东化工;2010年07期
目的研究苍术挥发油对成骨样细胞UMR-106的增殖作用。方法苍术挥发油和UMR106 成骨样细胞体外共同培养，用MTT 法检测细胞增殖。结果挥发油在0.001 mg/ml 培养48h具有最强的促进细胞增殖作用。结论苍术挥发油中可能含有促进成骨细胞增殖的活性成分。
【关键词】 苍术挥发油 增殖作用 成骨样细胞UMR－106 MTT 法
Abstract：ObjectiveTo research the proliferative effects of essential oil in Atractylodes lancea on osteoblast - UMR-106 cells .MethodsOsteoblasts－UMR-106 cells were cultured with essential oil of Atractylodes in vitro，and MTT method was used to detect the cell proliferation. ResultsEssential oil of Atractylodes lancea at a concentration of 0.001 mg/ml， within 48 h ，strongly stimulated the proliferation of UMR-106 cells.ConclusionEssential oil of Atractylodes lancea probably has some chemical compositions which can stimulate the proliferation of UMR-106 cells.
Key words：Essential oil in Atractylodes lancea; Proliferation effect; UMR-106 cell; MTT method
苍术（Rhizoma atratylodes）为菊科植物南苍术Atractylodes lancea ( Thunb.) DC.或北苍术Atractylodes chinensis Koidz.等的干燥根茎。苍术性辛、苦、温，归脾、胃、肝经，具有燥湿健脾、祛风散寒、明目作用。主治脘腹胀满、泄泻、水肿、风湿痹痛、风寒、感冒等［1］。
苍术在中医临床中使用十分广泛。已有研究发现苍术挥发油增加去卵巢雌性大鼠的骨钙含量（闫雪生《苍术油软胶囊的研制》。山东中医药大学硕士学位论文，2002），但对苍术挥发油是否影响成骨细胞的增殖，尚未见报道。本实验研究苍术挥发油对成骨细胞UMR-106的增殖作用。
1 材料与方法
1.1 材料
苍术药材购自上海德康药业有限公司，经中国第二军医大学药学院生药教研室黄宝康副教授鉴定为苍术Atractylodes lancea (Thunb.) DC.的干燥根茎。
1.2 试剂
DMEM 培养基(Cibco)；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基-四唑氢溴酸盐MTT(Sigma)；胎牛血清FBS(杭州四季青生物工程材料研究所)；胰蛋白酶(Cibco)；其它试剂均为国产分析纯。
1.3 方法
1.3.1 挥发油样品的制备水蒸气蒸馏法：将药材样品粉碎过40目筛，精确称取200 g的苍术，加水浸泡1 h，然后用挥发油提取器按常规水蒸气蒸馏，提取直至挥发油的量不再增加，蒸馏液用正己烷萃取，萃取液用无水硫酸钠干燥，过滤，微热蒸去溶剂得挥发油样品，挥发油样品为淡黄色透明油状物，具有刺激性气味。取50 mg挥发油样品溶于1 ml二甲基亚砜中，用灭菌过的0.2 mm 滤器( Gelmann Sciences) 除菌，并于4℃保存，备用。临用时用DMEM培养液稀释至所需浓度。
1.3.2 成骨样细胞UMR－106的培养［3］UMR－106 (大鼠成骨肉瘤细胞系) 细胞株获赠于江苏镇江医学院病原生物教研室，源于美国麻省医学院。将UMR-106细胞培养于10％胎牛血清（100KU/L青霉素，100 mg/ml链霉素）的无菌DMEM培养基中，置37℃，5%CO2培养箱中进行培养。取生长状态良好的细胞，用0.25％胰蛋白酶消化，加含胎牛血清的培养基制成细胞悬浮液，调整细胞浓度为5×106个/ml接种于100 ml培养瓶中，二氧化碳培养箱中孵育，2～3 d换液1次。
1.3.3 MTT 法测定细胞的增殖［2］取对数生长期细胞消化计数后，用含血清的DMEM 细胞培养液将细胞浓度稀释至1×105个/ml ，铺入96孔细胞培养板中(100 μl/孔)培养24 h后加入含不同浓度挥发油(每个浓度6孔)的无血清DMEM培养。结束培养4 h前弃去培养液，每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml，用PBS配制)继续孵育4 h，有蓝紫色沉淀生成，每孔加入150 μl二甲基亚砜(DMSO) ，振荡10 min待沉淀完全溶解，用酶标仪以550 nm 为测定波长、650 nm为参比波长测定吸光值，以不加中药的细胞孔测得的吸光值为空白，用t检验进行各加药组与空白组之间均值的比较。细胞增殖率的计算如下：
增殖率（%）= Ai实验组- Ao对照组Ao对照组×100%
Ai：不同条件下的吸光值；Ao：空白组的吸光值
2 结果
2.1 MTT 法测定细胞增殖与吸光度的关系将UMR-106细胞分别以6个不同浓度(1×105～1.2×106个)铺入96 孔板，培养8 h贴壁后，用上述方法测定每孔吸光度(Y)，与细胞数目(X)作线性回归，得标准曲线方程：Y=0.054+0.092 6×10-6X(r=0.986 0，n=6)，两者具有良好的线性关系。见图1。
2.2 挥发油对细胞增殖的作用用1，0.1，0.01，0.001 mg/ml 4种浓度的挥发油作用于细胞24 h，在λ＝550 nm测定其吸光值。结果见表1 。表1 不同挥发油浓度对UMR-106的增殖作用(略)
苍术挥发油浓度0.001 mg/ml时培养24 h，可明显促进细胞的增殖，细胞的增殖率为10.44%。在低的浓度下对细胞增殖有轻微的抑制作用，表明挥发油短期内使用低浓度较好。
为了观察挥发油促细胞增殖的最适宜的作用时间，用浓度为0.001 mg/ml的苍术挥发油作用于细胞分别为24，48，72 h ， 在λ＝550 nm测定其吸光值。结果见表2。表2 不同作用时间对细胞增殖的影响(略)
由表2可见，当挥发油在浓度为0.001 mg/ml作用24 h时能明显刺激UMR-106增殖，在近48 h时增殖率为20.96％， 达到最强，72 h 时细胞数目又下降。
3 讨论
苍术挥发油在0.001 mg/ml浓度下作用24，48 h，均对UMR-106增殖有明显的促进作用。UMR-106大鼠成骨肉瘤细胞系从形态和性质上都保留了成骨细胞独有的特征， 并且具有稳定、均一、纯度高等优点。 因此，UMR-106 细胞作为一种国际公认的成骨细胞系可以用来代替成骨细胞［3］。在骨形成最初阶段的成骨细胞增殖期， 成骨细胞数量增多， 形成多层细胞并合成、分泌I型胶原以便最终矿化形成骨结节。成骨样细胞的增殖与细胞培养液中药物的成分有关， 与成骨样细胞UMR-106共同体外培养的方法可能作为对骨形成有促进作用的活性化合物的筛选模型， 经过进一步的动物体内实验从这些活性药物中追踪对骨形成有促进作用的活性成分。因此，以成骨样细胞UMR-106 的增殖为活性指标，观察了苍术挥发油对该细胞系增殖的作用。由于采用的是苍术挥发油和细胞共同体外培养的方法，推测苍术挥发油中含有直接刺激成骨样细胞增殖的成分，为苍术治疗骨质疏松症提供初步筛选，具体机制有待进一步研究。
【参考文献】
Effect of CD24 on cell proliferation capability in melanoma cells
LI Ming, LI Yan, CHEN Wei-qiang, et al.School of Basic Courses, Guangdong Pharmaceutical College, Guangdong 510006, China
【Abstract】 Objective To study the effect of CD24 on the proliferation ability of melanoma cells. Methods B16F10 cells were transfect with pSi-CD24, a siRNA plasmid target to CD24. Then the expression of CD24 was measured by RT-PCR and Western blot and the cell proliferation was assessed by MTT assay. Results CD24 expression was obviously down-regulated by pSi-CD24, and knockdown CD24 can effectively inhibited the proliferation of melanoma cells. Conclusion CD24 can enhance the proliferation of melanoma cells in vitro, which indicated CD24 play an important role in tumor growth.
【Key words】 CD24; Tumor; Proliferation
CD24是一种低分子量高度糖基化的蛋白质粘附分子，作为P-选择素的配体之一，CD24参与介导单核细胞、中性粒细胞与内皮细胞、血小板之间的粘附。近年来，临床研究发现CD24高表达于多种肿瘤细胞表面，并且与肿瘤的预后密切相关［1］。对于其作用机制，以往研究较多的集中的CD24与肿瘤转移的关系上，而CD24在肿瘤增殖中的作用研究尚不十分明确。因此，本实验用siRNA干扰CD24的表达，观察抑制CD24表达对细胞的增殖的影响，初步探讨CD24在肿瘤生长中的作用。
1 资料与方法
1.1 试剂与仪器 引物、分子量Marker和质粒提取试剂盒(大连TaKaRa公司)；两步法RT-PCR试剂盒、Trizol 、Lipofectamine 2000 (美国Invitrogen 公司)；抗CD24 抗体和抗β-actin抗体(美国Santa Cruze公司)；ECL化学发光试剂盒(美国Pierce公司)； 蛋白电泳仪、电转仪、杂交箱和酶标仪(美国Bio-Rad公司)。人黑色素瘤细胞株B16F10为本室保存。靶向CD24的siRNA干扰质粒pSi-CD24由本室构建，按试剂盒说明书提取备用［2］。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养和转染 取对数生长期的人黑色素瘤细胞B16F10细胞，接种于6孔细胞培养板内，待细胞达到80%融合时，按照说明书用脂质体Lipofectamine 2000转染细胞。实验分为对照组和pSi-CD24组。
1.2.2 B16F10细胞中CD24 mRNA表达的变化 转染24 h
后，用Trizol法提取细胞总RNA，按照说明书以Oligo-d(T)18为引物逆转录合成第一链cDNA，用特异性引物扩增CD24和β-Actin。引物序列和扩增方法见本课题组前期发表的论文［2］。PCR产物用1.5%琼脂糖电泳，拍照，观察。
1.2.3 B16F10细胞中CD24蛋白表达的变化 转染48 h后按照试剂盒操作步骤提取细胞总蛋白，取20 μg样品煮沸变性后进行SDS-PAGE电泳，转膜，5 %的脱脂奶粉37℃封闭1 h，加抗CD24(1∶1000)或抗β-Actin(1∶1000)单克隆抗体，4℃孵育过夜，洗膜，加辣根过氧化物酶标记的相应二抗稀释液(1∶3000) 37℃孵育1 h，ECL法显影，常规洗片拍照。
1.2.4 pSi-CD24对B16F10细胞增殖的影响 取空白对照组和pSi-CD24组细胞细胞，接种至96孔板上，各组设4孔，在转染后0、24、48和72 h后加入MIT(5 mg/m1)20 μl，用MTT法检测细胞增殖情况，并绘制细胞生长曲线。
2 结果
2.1 pSi-CD24对CD24 mRNA和蛋白表达的影响 RT-PCR和Western blot结果显示，在正常情况下，黑色素瘤细胞B16F10高表达CD24，而转染重组质粒pSi-CD24后，B16F10细胞中CD24 mRNA和蛋白水平的表达均明显降低，说明重组质粒pSi-CD24能抑制CD24的表达。结果见图1。
2.2 pSi-CD24对B16F10细胞增殖的影响 MTT结果显示，转染pSi-CD24质粒后，黑色素瘤细胞B16F10的增值明显被抑制，在48 h和72 h与对照组差异有统计学意义。结果见图2。
3 讨论
RNA干扰(RNA interference, RNAi)是一种简单有效的基因沉默工具，主要通过诱导序列特异性的mRNA降解，从而产生相应的功能表型缺失，现已被广泛应用于基因治疗和功能基因组学的研究中［3］。在哺乳动物细胞的RNAi研究中，通过质粒等表达载体在细胞内直接转录形成siRNA具有经济和容易操作、作用持续时间长等优点，是目前siRNA最常用的方法。我们前期采用具有RNA聚合酶Ⅲ启动子的pSilencer 3.1载体，成功构建了靶向CD24基因的表达载体pSi-CD24［2］。本实验用RT-PCR和Western blot在黑色素瘤细胞B16F10中发现，转染pSi-CD24质粒后细胞CD24在mRNA水平和蛋白水平的表达较对照组均有明显降低，说明pSi-CD24可以在细胞内持续表达siRNA, 高效特异地抑制CD24的表达，为进一步研究CD24基因的功能和以CD24为靶点进行肿瘤治疗奠定了基础。
作为P-选择素的配体，CD24高表达能增强肿瘤的侵袭能力和转移能力［4］。研究发现，在病理情况下CD24和P-选择素介导了肿瘤细胞与血小板及内皮细胞的粘附与结合，肿瘤细胞与血小板结合后，形成血小板血栓，可以保护肿瘤细胞逃避免疫监视，降低免疫细胞对肿瘤的杀伤效应；肿瘤细胞和内皮细胞的粘附则有助于肿瘤细胞从循环系统转移到组织中形成转移灶，因此，CD24/P-选择素的结合被认为与肿瘤转移密切相关。还有研究证实CD24也介导了肿瘤细胞与纤维粘连蛋白等细胞外基质的粘附作用，敲除CD24可以降低SW620细胞的粘附能力［5］。CD24对肿瘤的生长也具有调控作用，Smith等发现敲除CD24基因导致肿瘤细胞凋亡增加［6］。有学者认为这与CD24能促进肿瘤微血管形成有关，也有研究认为与CD24促肿瘤细胞生长有关。本实验利用siRNA技术敲除黑色素瘤B16F10细胞CD24基因表达，发现抑制CD24表达可以降低细胞的增值能力，说明CD24可能通过某些信号途径促进肿瘤细胞增殖，进一步证实了上述结果。
综上所述，CD24在多种肿瘤中高表达，与肿瘤的生长、粘附和转移密切相关，抑制CD24表达可以降低肿瘤细胞的增殖能力、诱导肿瘤细胞凋亡、阻碍肿瘤的转移，因此CD24可能是一个治疗肿瘤的新靶点，但对其作用机制尚需进一步的深入研究。
参 考 文 献
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软骨缺损是骨科临床十分常见的疾病，但目前却尚无有效的治疗方法，无论是软骨的自体移植、同种异体移植、异体移植都无法满足整形外科及关节外科对软骨修复的需要。软骨组织工程的发展，为临床治疗软骨缺损提供了新的方法，其创造的人工软骨将是治疗软骨缺损的理想材料。
多向分化潜能的骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells，BMSc)具有来源广泛、体外培养时增殖分化能力强、在特定细胞因子诱导调控下向软骨分化等特点，被认为是组织工程化软骨中最理想的种子细胞。国内外学者经过多年探索，对BMSC的分化调控有了更深入研究。同时，随着中药研究水平的深入，中药通过诱导BMSC作用于软骨组织工程已有了的进一步的发展，现将情况总结如下：
1中药诱导BMSc增值及向软骨分化研究
1.1中药促进BMSc的增值
BMSC具有数量少、可自动分化等特点，不易控制其分化方向，过去研究证明中药可以对其增殖分化产生影响。柳海峰[1] 研究表明，补肾益骨汤提取物对体外培养的骨髓基质细胞增殖有明显促进作用。人参皂苷Rg1可以促进猪骨髓基质细胞的增殖分化，因为人参皂苷Rg1能够促进DNA的合成，促使细胞进入增殖周期，促进细胞内信号传导。舒晓春[2]骨碎补总黄酮能促进兔BMSCs增殖。
1.2中药诱导BMSC向软骨分化
中药及中药复方提取物是通过多途径、多靶点诱导BMSC向软骨细胞分化，并具有毒副作用小、价廉等优点。国内外诱导骨髓干细胞向软骨分化过多地使用化学制剂作诱导剂，有一定毒性或有较大副作用，应用于人体内可能存在不安全因素。国内研究者多从补肝肾、壮筋骨的中药或中药复方着手寻找安全、有效的中药诱导剂。
肖鲁伟[3]、李楠[4]龟鹿二仙胶汤含药血清、右归饮可以有效地诱导骨髓基质细胞定向分化为软骨细胞。吴政安[5]消痹灵中药复方剂体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞为类软骨细胞，诱导率与使用地塞米松、维生素、TGF诱导培养体系无明显差别。吴险峰[6]茶黄素在细胞转化过程中与TGF-β1有协同作用促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞转化，联合作用优于单纯TGF-β1。修忠标[7]鹿茸多肽对MSCs软骨细胞分化生物学行为的影响过程中与TGF一βl相似，在软骨诱导培养条件下可促进Ⅱ型胶原与GAG的表达。并且通过抑制Caspase-3mRNA表达及其蛋白酶活性以阻止或逆转软骨表型化MSCs凋亡。李明波[8]透骨消痛颗粒促进BMSC向软骨分化过程中Sox9因子的表达，并抑制Cbfal因子的表达，在一定程度上抑制其终末化，延缓软骨退变的过程。
总的来说，中药或中药复方提取物诱导BMSC向软骨分化可能与药物增加Sox9、TGF－β的合成及某些受体的数量，起到促进Ⅱ型胶原的合成，从而定向分化为软骨细胞。
2中药在软骨组织工程中的应用
目前组织工程学应用在临床上已经进入一个新的阶段，四六三医院[9-10]利用自体细胞注射治疗股骨头坏死，通过将患者骨髓干细胞的体外扩增并进行自体干细胞灌注，先后治疗55例酒精性股骨头坏死、122例缺血性股骨头坏死。研究提示，自体骨髓干细胞体外扩增的手段既解决异体移植的免疫排斥，同时避免种子细胞来源短缺等问题，诱导自体骨髓干细胞向软骨分化将是解决骨科中软骨缺损的希望。
中药已广泛应用于组织工程学的研究。例如：中药提取物制作成骨组织工程诱导修复材料―羊藿苷壳聚糖/羟基磷灰石复合材料[11]，具有良好的骨传导性和骨诱导活性，能有效填充骨缺损并促进早期成骨，是一种理想的骨组织工程诱导修复材料。中药双黄[12]能促进人牙周膜细胞增殖，为牙周组织工程的种子细胞提供了体外增值扩增的新方法。中药生肌液[13]能修复兔皮肤缺损，能够有效扩展皮肤缺损处的覆盖面积，缩短皮肤缺损的愈合时间。
目前，中药作用于软骨组织工程的研究还相对较少，主要通过中药灌胃配合BMSC复合体移植治疗软骨缺损、中药提取物体外对软骨器官或软骨细胞的促进作用这两方面来考察中药修复软骨缺损效果的机制。如羊藿[14]中药提取物能够在体外促进软骨器官生长和细胞增殖，七叶亭[15]灌胃修复兔骨关节软骨缺损、独活寄生汤结合骨髓基质干细胞复合体修复兔膝关节软骨缺损等等。此外，张猛[16]对藻酸钠载体复合软骨细胞在黄茂甲昔作用下成软骨作用及机制进行实验性研究、金翔[17]对威灵仙干预可注射性C/β-GP凝胶复合同种异体软骨细胞体外三维培养及修复软骨缺损进行了研究。在寻找合适BMSC软骨分化的三维立体材料过程中，中药制剂学在组织工程中越来越受到了的重视，研究与应用将越来越广泛。
3展望
中医药文化是我国的文化宝藏，中医辨证施治可以显著减缓或抑制早期膝骨关节炎的关节软骨退变、减少关节滑液分泌、在软骨破坏区出现大量幼稚软骨细胞，减轻膝骨关节炎的严重程度[18]。中药如：骨碎补[19]、羊藿、秦皮、威灵仙、龟板等，中药复方如：独活寄生汤[20]、补肾健腰合剂[21]、复元胶囊[22]、腰痛舒胶囊[23]、强肌健力饮[24]等，都能保护软骨细胞、有效促进软骨的修复，治疗关节炎等作用。
目前存在的主要问题是中药诱导剂的研究层面停留在体外对BMSC的软骨分化效应上，而对关节软骨细胞的再生修复机理上不完全明了。而中药成分复杂，如何精确调控BMSc向软骨细胞转化成为研究难点。中药诱导剂的研究目前处于起步阶段，国内的相关文献较少，有待学者们进一步研究，但相信在不久将来，中药诱导BMSC向软骨细胞分化的作用途径和机制，能从分子细胞水平上得到进一步的阐释，更快地用于指导临床治疗工作。
参考文献
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[摘要] 多发性骨髓瘤（MM）属于一种血液系统肿瘤，基因染色体的突变、MM瘤细胞和骨髓微环境的交流等均在其发病过程中发挥着至关重要的作用。近年来，临床治疗MM的热点已经转变为对MM和骨髓微环境关系进行深入的研究，对各条异常活化的信号通路进行有针对性的治疗过程中运用靶向药物。该研究首先概述了骨髓微环境在MM 发病机制中的作用，然后从沙利度胺及其衍生物、蛋白酶体抑制剂、免疫治疗与分子生物学治疗三个方面对骨髓微环境在多发性骨髓瘤靶向治疗近况进行了分析探讨。
关键词 骨髓微环境；多发性骨髓瘤（MM）；发病机制；作用；靶向治疗近况
[中图分类号] R738 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2014）07（c）－0197-02
[作者简介] 董进梅（1973-），女，彝族，云南普洱人，本科，副主任医师。
骨髓微环境中各种成分能够促进MM瘤细胞的生存、增殖等，其途径是多条信号转导通路的异常活化。目前，临床关注的焦点是对MM在骨髓中的发病机制有一个清晰的认识，促进靶向治疗针对性的显著提升及药物对MM细胞毒性的显著增强，对耐药进行有效的防止，对患者的预后进行切实有效的改善等。该文现就骨髓微环境在多发性骨髓瘤发病机制中的作用及靶向治疗近况作如下综述。
1 骨髓微环境在MM 发病机制中的作用
MM能够促进IL-6的旁分泌，具体机制为通过黏附分子和细胞外基质蛋白，也就是黏附骨髓基质细胞，而IL-6又能够进一步促进MM细胞的增殖及存活，并对其进行有效的维持。Chatterjee等医学学者研究发现，人MM细胞的存活在存在骨髓基质细胞的情况下不会对IL-6 /gp130 / Stat3信号通路进行以来。同时证实，MM的发生和发展有黏附分子异常表达的参与，我们可以从以下两个方面看黏附分子异常表达对MM发病机制的影响：①促进骨髓瘤前提细胞的归巢；②促进破骨细胞激活因子及骨髓瘤细胞生长因子的产生。MM细胞的归巢的介导因素为CD44、ICMA-1、MPC-1 (CD11b)、VLA-4、VLA-5等[1]。MM结合基质蛋白及黏附基质细胞的情况下均会在极大程度上调节MM细胞的生长，具体机制为通过syndecan- 1和N 型胶原、VLA-4和纤连蛋白的作用及VLA-4（位于MM细胞表面）结合VCVM-1（属于基质细胞）。MM细胞的生长和生存可以在syndecan -1黏附机制下得到极大的发展，对基质金属蛋白酶(MMP) -1进行诱导，使其产生，从而为骨的吸收及肿瘤的浸润提供良好的前提条件。P27及其他相关基因表达水平会在MM细胞黏附纤连蛋白的情况下上升，进而对细胞耐药进行介导。IL-6的转录及分泌一方面会在MM黏附基质细胞的作用下发生重大改变，另一方面还会在MM细胞本身分泌VEGF等的作用下发生重大改变，而IL-6的转录和分泌以来基质细胞NF-JB[2]。
2 骨髓微环境在多发性骨髓瘤靶向治疗近况
2.1 沙利度胺及其衍生物
2.1.1 沙利度胺 20世纪50年代，沙利度胺首次进入欧洲市场。沙利度胺属于一种镇静剂，曾经在孕妇妊娠呕吐的治疗中得到了一定的应用，但是由于其会引发严重的并发症，如胎儿畸形等，因此逐渐退出了市场[3]。Singhal等医学学者在1999年对沙利度胺在复发及难治性多发性骨髓瘤中的良好临床疗效进行了首次报道，发现沙利度胺将其抗肿瘤作用发挥出来的具体机制可以从以下几个方面看出：①沙利度胺能够对新生血管生成进行有效的抵抗；②沙利度胺能够对细胞表面粘附因子进行有效的调节，同时对其相互间的作用有着深远的影响；③会对瘤细胞及基质细胞的多种细胞因子分泌造成极大程度的影响，将其生物活性改变；④在T和NK细胞上作用能够促进宿主免疫杀伤骨髓瘤细胞作用的显著增强[4]。
2.1.2 沙利度胺衍生物 在MM的治疗中，沙利度胺衍生物具有令人满意的临床疗效，磷酸二酯酶抑制剂和非磷酸二酯酶抑制剂是其主要的分类，其中磷酸二酯酶抑制剂属于选择性细胞因子抑制剂，能够对肿瘤坏死因子-A（TNF-A）进行有效的抑制，不会激活T细胞；非磷酸二酯酶抑制剂属于免疫调节药物，能够将T细胞显著激活，对IL-2及INF-C进行刺激[5]。免疫调节药物来那度胺是美国Celgene公司研发出来的，对T细胞增殖能力进行激活的能力及对IL-2及INF-C分泌的刺激能力均明显比沙利度胺大。来那度胺还能够将MM细胞的耐药有效克服掉，从而对MM细胞的生长进行有效的抑制。在其作用下，对美法仑及丝裂霉素等和地塞米松耐药的受益患者分别达到了总数的20%~35%和50%[6]。此外，来那度胺还能够促进地塞米松抗MM作用的显著增强。所有这些均告诉我们，在耐药MM的治疗中，来那度胺具有极为广阔的应用前景。
2.2 蛋白酶体抑制剂
硼替佐米属于蛋白酶体抑制剂，是FDA在2003年批准用药，在复发性难治性MM的治疗中具有良好的应用效果，其能够对蛋白酶体26S亚基进行特异性抑制，促进I-JB降解的极大减少，并对NF-JB活性及IL-6触发的MAPK生长信号进行抑制，从而对MM细胞的增生进行有效的抑制，组织MM细胞粘连骨髓基质细胞( BMSC )，对其进行诱导，使其凋亡，对NF-JB激活产生的耐药性进行有效的防止，同时切实有效地保护抗IL-6，对骨髓血管的新生造成阻碍，促进DEX疗效的显著增强[7]。在初发MM的治疗中，单药硼替佐米达到了40%左右的缓解率，而硼替佐米+美法仑+泼尼松(VMP)、硼替佐米+ 沙利度胺+ 地塞米松(VTD)等联合方案则能够达到70%~90%的缓解率[8]。目前，临床相关医学学者正在通过实验对第二代蛋白酶体抑制剂进行研究，预计其对肿瘤细胞的作用将明显比硼替佐米高，而其不良反应则将明显比硼替佐米低。
2.3 免疫治疗与分子生物学治疗
在临床肿瘤的治疗过程中，大量应用细胞因子的治疗方法在重组基因工程技术中运用细胞因子疗法的情况下成为可能，而目前，在MM的治疗中，白介素-2（IL-2）、IFN-C等是具有较为广泛应用的细胞因子。IFN-A属于多功能细胞因子，能够对病毒及肿瘤细胞增殖活性进行有效的抵抗，同时还能够对人体免疫功能进行有效的调节[9]。相关医学研究表明，如果MM患者伴有微小残留病，那么IFN-A将会具有更为有效的治疗效果[10]。近年来，在多发性骨髓瘤的治疗中，IFN-A已经得到了日益广泛的应用，特别是在维持治疗诱导缓解后或自体造血干细胞移植后的MM的治疗中更是具有无比的优越性。IL-2在宿主抗肿瘤免疫的细胞因子中占有极为重要的地位，在极大程度上调节着细胞因子网络，能够对T细胞的增殖和分化进行有效的刺激，对其进行诱导使其产生细胞毒性T细胞，显著增加NK细胞的数目，对B细胞进行刺激使其增殖分化，对T细胞进行有效使其将IFN-A和IFN-C分泌出来，同时使移植物抗肿瘤效应有效产生，将产生LAK细胞激活，在许多体内、体外的肿瘤细胞中溶解，途径为MHC非限制性方式[11-12]。
综上所述，骨髓微环境在多发性骨髓瘤的发病机制中发挥着至关重要的作用，靶向治疗中沙利度胺在补救治疗初发骨髓瘤的过程中具有极为重要的作用，而ATO、VEGF受体抑制剂、法尼基转移酶抑制剂等则在稳定复发或难治MM患者的过程中具有极为重要的作用。目前，对患者进行有效的分类，然后运用有针对性的措施对患者进行治疗仍然是临床需要关注的课题。广大相关医学学者应该更进一步深入细致地研究多发性骨髓瘤靶向治疗等方法，以为减轻患者病痛、提升对患者治疗的有效率及医院的综合效益做出积极的贡献。
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（收稿日期：2014-04-29）
论文中医学名词术语的使用
1.冠以外国人名的体征、病名、试验、综合征、方法、手术等，人名可以译成汉语，但人名后不加“氏”字；也可以用外文，但人名后不加“′s”。例如：Babinski征，可以写成巴宾斯基征，不写成Babinski′s征，也不写成巴宾斯基氏征。若为单字名则仍保留“氏”字。例如：福氏杆菌。
【关键词】 HSG；结直肠癌；良性腺瘤；正常粘膜
增殖抑制基因 (hyperplasic suppress gene，HSG) 是陈光慧等[1，2]利用 mRNA差异显示技术从正常血压和高血压大鼠的血管平滑肌细胞中发现的新基因。前期的研究表明，高血压动物模型中HSG在增生活跃的血管平滑肌中呈低水平表达，而且转染外源性HSG可明显地抑制血管平滑肌细胞的生长，转染外源性HSG对多种肿瘤传代细胞系同样也具有明显的生长抑制和诱导凋亡的作用[3]。本文旨在观察HSG在不同结直肠组织中的表达变化，初步探讨HSG对结直肠癌演变的影响。
1 资料和方法
1.1 临床资料
收集唐山市工人医院 2003 年 12 月～2005 年 12 月手术切除的直肠癌标本 53 例，高分化癌 20 例，中分化癌 20 例，低分化癌 13例；其中男24 例，女29 例，年龄41 ～75 岁，平均年龄 56 岁；Ⅰ+Ⅱ期 20 例，Ⅲ+Ⅳ期 33 例。淋巴结转移阳性31例，淋巴结转移阴性22例。所有患者术前均未进行放疗、化疗或激素治疗。以良性腺瘤标本31例和正常人粘膜组织37例做对照。
1.2 主要试剂
兔抗人 HRG1 多克隆抗体由北京大学陈光慧教授馈赠；免疫组织化学染色试剂盒购自美国Santa Cruz 公司。
1.3 实验方法
石蜡切片组织55℃烤4h后，常规脱蜡至水，3% H2O2 去除内源性过氧化物酶，蛋白酶K 37℃ 消化10min，兔血清封闭非特异性抗原，加入HSG抗体，室温过夜，生物素标记二抗，酶标三抗，室温孵育各20min，DAB 显色，苏木精复染核，脱水，透明和封片。
1.4 结果判定
HSG以细胞浆、细胞膜或细胞核出现棕黄色颗粒，且其着色强度显著高于背景者判定为阳性。
HSG计量方法：蛋白表达的判定以染色强度和阳性细胞百分率的得分之和进行评定。（a）染色强度：阴性为 0，弱阳性为 1，阳性为 2，强阳性为 3；（b）阳性细胞百分率：无阳性细胞为 0，＜25% 为1，26%～50%为2，＞50%为3，a+b之和最高为6，0～2判为阴性，3～6判为阳性。
应用Image Pro plus数码分析系统进行图像分析，在光学显微镜下随机选取5个视野，测定细胞的平均光密度值和累计光密度值，计算测得值的平均值作为最终值。
1.5 统计学分析
所有数据以±s表示，SPSS11.0软件处理。样本均数的比较采用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义，计数资料采用χ2检验。
2 结果
2.1 HSG在结直肠不同组织中的表达
HSG 阳性染色主要集中于细胞核周围，呈棕黄色颗粒，细胞浆有少量表达，见图1、2、3。在结直肠癌中，HSG蛋白表达的平均光密度值和累积光密度值明显低于正常粘膜和良性腺瘤对照组（P＜0.05），而正常粘膜和良性腺瘤组的HSG值差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。表1 HSG在结直肠不同组织中的光密度值 *P＜0.01，同良性腺瘤组比较；P＜0.01，同正常粘膜组比较
与正常粘膜和良性腺瘤组比较，结直肠癌组 HSG 表达率呈下降趋势，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表2。表2 HSG在结直肠不同组织中的表达 * χ2=4.389 P＜0.05 ，同良性腺瘤组比较；χ2=16.729 P＜0.01，同正常粘膜组比较
2.2 HSG与结直肠癌临床病理参数之间的关系
HSG在高、中、低分化癌组织中的表达分别为45.5% (9/20)、55.0% (11/20)、53.8%（7/13），χ2=0.458，P=0.795，差异无统计学意义；HSG在淋巴结转移阳性组表达率38.7% (12/31) 显著低于淋巴结转移阴性组68.2% (15/22)，χ2=4.474，P=0.034；直肠癌Ⅲ+Ⅳ期中HSG阳性表达率为33.3% (11/33)，显著低于Ⅰ+Ⅱ期中的80.0%(16/20)，χ2=4.74，P=0.029。
3 讨论
增殖抑制基因（HSG）是陈光慧等利用mRNA差异显示技术对SHR和WKY大鼠血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)cDNA文库进行筛选时分离得到的一个与VSMC增殖相关的新基因，因其在SHR和VSMC中表达活性降低而得名。基因全长4.16kb，可编码661个氨基酸，后来发现，该基因不仅在血管平滑肌内皮细胞中表达，在心、肾、脑、肺、肝、白细胞等不同组织中也有广泛分布。有研究揭示，转染hrg1蛋白能抑制Raf (Raf1)和丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)活性，下调抗细胞凋亡基因(bcl2)和增殖细胞核抗原(PCNA)基因表达及抑制细胞增殖[4]。姜广建[5]等发现HSG通过上调p27和下调cyclinE表达而发挥抑制VSMC增殖的作用。Santel等[6]发现，该基因可以控制线粒体的形态学变化，因而也与一些人类疾病相关，并在细胞信息的传导中起着重要的作用。HSG定位于人的1p36.3位置，此区域为许多肿瘤的突变高发区，许多肿瘤患者染色体的这一区带会出现缺失或易位。王萍[7]等研究发现HSG对多种肿瘤传代细胞系具有明显的增殖抑制作用，与放线菌酮(CHX)并用可增强肿瘤细胞对 CHX的敏感性，具有协同作用，提示HSG有可能是新的抑癌基因。
目前，国内外尚无对HSG在肿瘤发生发展中表达变化的相关研究报道。本研究利用免疫组化法检测结直肠癌、良性腺瘤和正常粘膜组织中的HSG表达，以期探讨HSG是否具有抑制结直肠癌的恶性细胞增殖作用。结果表明：在结直肠癌组中，HSG蛋白的表达低于良性腺瘤组及正常粘膜组，而良性腺瘤与正常粘膜组表达无差异，提示HSG的表达可能在抑制细胞恶性增殖中及结直肠癌的发生发展中起一定作用。这与李志新[8]观察的外源性转染大鼠HSG（rHSG）对肿瘤细胞具有明显且广泛的生长抑制作用结果相似。
HSG表达与肿瘤分化程度无关，而与肿瘤淋巴结转移和临床病理分期密切相关，提示HSG有望作为判定肿瘤分化程度、病理分期的一种新的参考指标。
参考文献
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