保险心得及感悟样例十一篇

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篇1

【关键词】 组蛋白脱乙酰基酶2；血管紧张素Ⅱ；心肌细胞；肥大；反义脱氧寡核苷酸

心肌细胞肥大是一种复杂的、多种因素参与调节的动态过程，包括血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）在内的多种化学因素、多种机械刺激的作用都有可能导致心肌细胞的肥大。尽管对于其中的内在机制尚未完全明确，目前认为在心脏肥大的细胞信号传导通路中，组蛋白脱乙酰基酶（histone deacetylases，HDACs）可能是一个重要的终极靶点〔1〕。HDACs分为三类，其中Ⅰ类HDACs被推断认为有可能对于心肌肥厚发挥着促进作用，但目前有待于进一步明确〔2〕。本课题组以Ⅰ类HDACs之一——组蛋白脱乙酰基酶2(HDAC2）为着眼点，以AngⅡ刺激心肌细胞造成肥大，给予HDAC2反义脱氧寡核苷酸和HDACs抑制剂——丙戊酸进行干预。通过观察HDAC2在这一过程中的变化，以求证其对心肌细胞肥大的促进作用；同时也可证明丙戊酸作为临床上常用的一种抗癫痫药物，对于心肌肥厚有一定的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 材料

新生1～3 d Wistar乳鼠，由哈尔滨医科大学附属第二医院实验动物中心提供。胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司。DMEM，美国Hyclone公司。兔多克隆抗体人HDAC2（H54）及羊抗兔抗体，美国Santa Cruz公司产品。丙戊酸钠，美国Sigma公司。二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司。逆转录聚合酶链反应（RTPCR）试剂，TakaRa公司。相差光学显微镜，Nikon eclipse ts100。紫外透射检测分析仪FS312，上海复生生物工程研究所。RTPCR引物和HDAC2错义脱氧核苷酸序列由北京奥科公司合成。FuGENE 6，瑞士Roche公司。

1.2 FuGENE 6转染反义脱氧寡核苷酸

按照FuGENE 6说明书进行操作。于无菌试管中预先放入97 μl无血清培养液，加入FuGENE 6 3 μl，室温下孵育5 min。加入HDAC2反义脱氧寡核苷酸 2 μg形成混合物，混匀后均于室温下孵育30 min。反义寡聚脱氧核苷酸(ASODN)序列为5′GATGGGAAGGAGAGCAGCACAG3′。

1.3 心肌细胞培养

取新生2～3 d Wistar乳鼠心脏，放入含无血清DMEM培养液的平皿中。去除心房心包膜及附属大血管后，0.25%胰酶反复消化、取上清，将收集的上清液用2 000 r/min离心10 min。弃上清，在离心管中加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液，将细胞重悬，细胞计数。按细胞数2×105/ml接种于6孔板培养。细胞分为正常对照组、肥大组、反义组和丙戊酸组。肥大组、反义组和丙戊酸组均加入10-5 mol/L AngⅡ，AngⅡ终浓度为2×10-7 mol/L；反义组加入于上述HDAC2反义脱氧寡核苷酸混合物；丙戊酸组加入丙戊酸，其终浓度为10-3mol/L；正常对照组仅加入等量无血清培养液。加入AngⅡ后12 h和24 h进行以下检测。

1.4 相差显微镜下观察细胞面积变化

各组均随机选取10个视野，每个视野随机选取10个心肌细胞，在1 600倍下应用Motic Images 1.3软件测量心肌细胞面积，计算平均值。

1.5 RTPCR检测HDAC2 mRNA表达

以Trizol (Invitrogen公司产品)提取心肌细胞中的总RNA，用紫外分光光度计测总RNA纯度和含量，按照TaKaRa RTPCR试剂盒说明书进行操作。HDAC2基因引物序列：上游：5′GCT CGA TGT TGG ACG TAT GAG AC3′；下游：5′ACC TCC TTC ACC TTC ATC CTC AG3′；扩增片段长度为364 bp。βactin基因引物序列：上游：5′TTG TAA CCA ACT GGG ACG ATA TGG3′；下游：5′GAT CTT GAT CTT CAT GGT GCT AGG3′；扩增片段长度为764 bp。逆转录条件：42℃ 30 min，99℃ 5 min，5℃ 5 min，4℃ 贮存。PCR反应条件：94℃ 5 min，94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 70 s，共进行30个循环；72℃ 7 min，4℃贮存。PCR产物经1%琼脂糖电泳，经紫外透射分析拍摄电泳条带。以βactin为内参照，结果以HDAC2/βactin比值表示。

1.6 免疫组化法检测HDAC2蛋白表达

取出各组无菌细胞培养玻片，无菌冷丙酮固定20 min。置于0.3% H2O2中30 min抑制内源性过氧化物酶。加入一抗(兔多克隆HDAC2抗体)4℃过夜。加入二抗（羊抗兔抗体），室温下2 h。DAB显色。苏木素复染。乙醇脱水，二甲苯脱乙醇，封片。镜下观察，HDAC2以细胞核棕黄色为阳性。采用镜下随机选取10个视野，分别计算HDAC2表达阳性心肌细胞的百分数。

1.7 统计结果

数据以x±s表示，采用SPSS 12.0软件包进行单因素方差分析。

2 结果

2.1 心肌细胞面积的改变

在1 600倍下，正常对照组、反义组和丙戊酸组心肌细胞面积在12 h、24 h点均低于肥大组，差异有统计学意义（P＜0.05）；但反义组和丙戊酸组心肌细胞面积仍高于对照组（P＜0.05）。反义组和丙戊酸组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。表1 各组心肌细胞面积的检测（略）

2.2 HDAC2 mRNA表达检测结果

正常对照组、反义组和丙戊酸组心肌细胞HDAC2 mRNA表达在12 h、24 h点均低于肥大组，差异有统计学意义（P＜0.05）；但反义组和丙戊酸组仍高于对照组（P＜0.05）。反义组和丙戊酸组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。表2 各组心肌细胞HDAC2 mRNA的表达(略)

2.3 HDAC2蛋白表达

正常对照组、反义组和丙戊酸组心肌细胞HDAC2蛋白表达在12 h、24 h点均低于肥大组，差异有统计学意义（P＜0.05）；但反义组和丙戊酸组仍高于对照组（P＜0.05）。反义组和丙戊酸组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。表3 各组心肌细胞HDAC2蛋白检测结果(略)

3 讨论

蛋白的乙酰化和去乙酰化是蛋白活性调节的一种重要形式，通过乙酰化或去乙酰化，可以改变染色质的结构或者是转录因子的活性，从而可以调节基因转录的活性。真核生物染色质的基本单位——核小体是由核心组蛋白和DNA组成，核心组蛋白的乙酰化与去乙酰化是基因表达过程中重要的调控方式之一〔3〕。催化组蛋白去乙酰化的酶组蛋白脱乙酰基酶分为三类，这三类HDACs中，仅前两类与核心组蛋白的去乙酰化相关，Ⅲ类HDACs则无此作用，因此目前认为仅前两类参与对基因转录的调节〔4，5〕。研究结果显示Ⅱ类HDACs在心肌细胞肥大过程中发挥一定的抑制作用〔2，6〕，并推断Ⅰ类HDACs发挥着促进作用〔7〕。本实验结果证实了Ⅰ类HDACs在这一过程中有一定的促进作用，与其他学者在大体动物实验中的研究结果是一致的〔8〕。

目前对于HDAC2在心肌细胞肥大过程中发挥促进作用的具体机制尚未完全明确，结合其结构特点以及先前研究结果推测，HDAC2对基因转录的调节作用可能是通过参与辅阻遏物的形成而实现的。在辅阻遏物mSin3中，主要成分包括核受体辅助抑制因子(NcoR)、甲状腺沉默介导因子(SMRT)、Sin3、组蛋白去乙酰化酶(HDAC2)。该复合物与核受体、Mad/Max等转录因子结合，并且通过Sin3募集HDAC2到特定基因的调控区，通过对组蛋白去乙酰化而发挥抑制作用。另外，HDAC2与一种特殊的心脏特异性基因转录调节因子——Hop蛋白（Homeodomain only protein）有着密切关切〔7〕。具体内在关联尚有待于深入研究。

另外，本文结果表明了HDAC2反义脱氧寡核苷酸和HDAC抑制剂对于心肌细胞肥大的抑制作用。丙戊酸是20世纪70年代开始应用于临床的一种广谱抗癫痫药，多年的临床实践证实了丙戊酸的良好耐受性。其治疗癫痫的作用机制为增强γ氨基丁酸(GABA)的抑制作用，稳定膜的兴奋性，主要用于各种类型的癫痫发作，亦可用于癫痫持续状态。但是直到近些年才发现丙戊酸还是一种选择性Ⅰ类HDACs抑制物，而且这一抑制作用与其治疗性抗癫痫作用不同。其对心脏肥大的抑制作用有着重要的意义，对于这方面的研究有必要进一步从临床研究的角度加以证实。

参考文献

1 Frey N，Katus HA，Olson EN，et al.Hypertrophy of the heart：a new therapeutic target〔J〕? Circulation，2004;109（13）:15809.

2 Zhang CL，McKinsey TA，Chang S，et al.Class Ⅱ histone deacetylases act as signalresponsive repressors of cardiac hypertrophy〔J〕.Cell，2002;110(4):47988.

3 刘红利，陈燕.组蛋白乙酰化/去乙酰化及其在恶性血液病中的研究进展〔J〕.现代临床医学生物工程学杂志，2003;9(2):1468.

4 Simpson P.Stimulation of hypertrophy of cultured neonatal rat heart cells through an alpha 1adrenergic receptor and induction of beating through an alpha 1and beta 1adrenergic receptor interaction.Evidence for independent regulation of growth and beating〔J〕.Circ Res，1985;56（6）:88494.

5 Izumo S，NadalGinard B，Mahdavi V.Protooncogene induction and reprogramming of cardiac gene expression produced by pressure overload〔J〕. Proc Natl Acad Sci USA，1988;85(2):33943.

篇2

一氧化氮合酶

Role of the tetrahydrobiopterin in Myocardial preconditioning: Possible Involvement of Mitochondrial KATP Channels and Nitric Oxide Synthase

ZHONG Biao1, ZHONG Huan-qing2, CHEN Hai-sheng2.

1.Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Huizhou Municipal Central Hospital, Huizhou, Guangdong Province, 516000, China

2.Department of Cardiovascular Surgery, Gaozhou People’s Hospital, Maoming, Guangdong Province, 525200, China

【Abstract】ObjectiveTo study the effect of tetrahydrobiopterin(BH4),5-hydroxydecanoate (5-HD) and Nω- nitro-L-arginine methyl ester(L-NAME) on langendorff rabbit heart model. MethodsSixty-four mature rabbits were randomly divided into four groups. The hearts in vitro removed to Langendoff equipment, then perfused with different buffer solution base on the Krebs-Henseleit buffer(KHB) for 30min. Then cardiac arrest was induced for 30min followed by 60min reperfusion. Coronary flow(CF) was recorded. Coronary effluent solution was collected for CK measurion. The dynamic change of myocardial NO content was measured. ResultsBy the treatment with BH4, CF was significantly increased, and CK was decreased than other groups after reperfusion(P

【Key words】 Tetrahydrobiopterin; Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury; ATP-Sensitive Potassium Channels; Nitric Oxide Synthase

BH4是所有NOS同功酶的辅助因子，具有稳定NOS结构、稳定NOS活性二聚体、增加L-精氨酸和NOS结合力、促进NO的合成与释放等作用，与内皮功能密切相关[1,2]。外源性补充BH4能保护缺血再灌注心肌[3]，但是具体作用机制仍不清楚。本实验通过观察四氢生物蝶呤(tetrahydrobiopterin, BH4)、5-羟基癸酸盐(5-hydroxydecanoate, 5-HD) 和左旋硝基精氨酸甲酯(Nω-nitro-L-arginine methyl ester, L-NAME)对缺血再灌注心脏冠脉流量（coronary flow, CF）、一氧化氮(nitric oxide, NO)含量、肌酸激酶（creatine kinase, CK）的影响，研究线粒体三磷酸腺苷敏感性钾通道(mitochondrial ATP-sensitive potassium channel, mitoKATP) 、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)对四氢生物蝶呤减轻心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia reperfusion injury, MIRI）作用的影响，探讨四氢生物蝶呤保护缺血再灌注心肌作用的可能机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物与分组

健康成熟的大白兔64只(广东医学院动物中心提供，体质量2.0~2.5 kg，雄雌各半)，随机数字表法随机分入对照组（组Ⅰ）和BH4组（组Ⅱ）、BH4+ L-NAME组（组Ⅲ）、BH4+5-HD组（组Ⅳ），每组16只。

1.2 主要仪器和试剂

自制Langendorff离体心脏灌注装置，全自动生化分析仪(美国Beckman公司, CX-4 型)，L-NAME、5-HD、BH4购自美国Sigma公司。NO检测试剂盒购自南京建成生物有限公司。

1.3 离体心脏Langendorff灌流模型

实验动物3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉，肝素钠(150 IU/kg)抗凝后，迅速开胸取出心脏，立即浸入4℃ K-H液中，排尽残血，连接于Langendorff模型灌注装置上，以37℃ K-H液经主动脉插管逆行灌注30 min，灌注压恒定为70 cm H2O，灌注液持续通入95%O2-5%CO2混合气(流量3 L/min)。停搏前20 min BH4+ L-NAME组（组Ⅲ）、BH4+5-HD组（组Ⅳ）分别用加入L-NAME、5-HD的K-H液进行灌注10min。停搏前10 min BH4组（组Ⅱ）、BH4+ L-NAME组、BH4+5-HD组均用加入BH4的K-H液灌10 min。经30 min灌流后，灌注40 ml 4℃ St. Thomas心脏停搏液进行停搏，时间30 s。心脏停跳期间温度保持在37℃~38℃。心脏缺血30 min后，以37℃ K-H液再灌注60 min。

BH4、5-HD、L-NAME最终浓度为10、100、100 μmol/L。

1.4 观察指标及方法

1.4.1 在灌注10min、再灌注10 min、再灌注30 min、再灌注60 min4个时点收集冠脉流出液记录冠脉流量CF。

1.4.2 全自动生化分析仪分析上述4个时点冠状动脉流出液CK含量。

1.4.3 分别取缺血30 min、再灌注60 min的心室肌，硝酸还原酶法测定心肌组织NO含量。

1.5 统计学处理

数据以均值±标注差（ ±s）表示，用SPSS 13.0软件进行统计学分析。组间、组内数据比较均用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1与对照组相比，用含BH4的K-H液灌注的组Ⅱ再灌注后的CF、心肌组织NO含量增加(P

2.2使用含NOS抑制剂L-NAME（组Ⅲ）或mitoKATP抑制剂5-HD（组Ⅳ）预处理，与组Ⅱ相比，CF降低(P

3 讨论

内、外源性NO在缺血预适应(ischemia preconditioning, IP)心肌保护中(包括早期、第二期)起重要作用，不仅是触发因子，也是效应因子[4]。机体内产生的NO是由NOS催化非必需氨基酸左旋精氨酸(L-arginine, L-Arg)和O2生成的。BH4是所有NOS同功酶的辅助因子 [1-2]。内源性NO的生成量严格依赖适当的BH4水平[5]。BH4水平的减少可导致NOS功能失调，产生过量的氧自由基而代替NO的产生，进而导致内皮和心肌细胞功能降低[6]。

CK绝大部分存在于心肌细胞胞浆内，心肌细胞以外含量甚微，是一种心肌特异性酶。所以，检测冠脉回流液中CK的含量可以反映心肌酶漏出的程度，间接反映心肌损伤程度[7]。CF的多少则可反映冠状动脉的扩张程度，从而观察冠脉内皮细胞的功能和损伤程度。

mitoKATP被公认为是心肌保护作用中的一个关键环节[8]。mitoKATP的开放不仅参与IP的第一窗保护作用，而且也参与第二窗保护作用，不仅能作为启动因子诱导IP，同时也是IP重要的效应器。它的开放能减轻MIRI [9]。

实验结果提示外源性BH4可提高NOS的活性，促进内源性NO的产生，发挥NO对心肌和冠状血管内皮的保护作用，减少CK的漏出，增加CF。表明BH4能增强冠脉系统的扩张，有利于停搏液在心肌的均匀分布和降温，而在再灌注时则促进有害物质排出，减轻心肌酶的漏出，从而减轻心肌损伤，而这种保护作用也与mitoKATP的开放有关。

参考文献

[1] Fukuda Y, Teragawa H, Matsuda K, et al. Tetrahydrobiopterin restores endothelial function of coronary arteries in patients with hypercholesterolaemia. Heart, 2002,87(3):264-269.

[2] Higashi Y, Sasaki S , Nakagawa K, et al. Tetrahydrobiopterin enhances forearm vascular response to acetylcholine in both normotensive and hypertensive individuals. Am J Hypertens, 2002, 15(4):326-332.

[3] Werner ER, Antonius C.F. Gorren, Regine H, et al. Tetrahydrobiopterin and nitric oxide: Mechanistic and pharmacological aspects.Experimental Biology and Medicine, 2003, 228(11): 1291-1302.

[4] Lochnerl A, Marais E, Du Toit E, et al. Nitric Oxide Triggers Classic Ischemic Preconditioning. Ann. N.Y. Acad. Sci., 2002, 962(5): 402-414.

[5] Katusic ZS. Vascular endothelial dysfunction:does tetrahydrobiopterin play a role? Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2001, 281(3):981-986.

[6] Xia Y, Tsai AL, Berka V, et al. Superoxide generation from endothelial nitric oxide synthase: A Ca2+/calmodulin-dependent and tetrahydrobiopterin regulatory process. J Biol Chem, 1998, 273(40):25804-25808.