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2小GIST的临床诊断
目前，临床上诊断小GIST的诊断手段主要包括胃镜、结肠镜及小肠镜等纤维内镜、胶囊内镜、EUS、增强CT及氟代脱氧葡萄糖正电子发射断层扫描（FDG-PET）等检查。对于胃肠道黏膜下的小GIST，纤维内镜及胶囊内镜一般可以直视发现；但GIST多具有外生性壁外生长的特性，对于GIST壁外部位的大小难以界定，同时也难以区分GIST位于胃肠壁内亦或壁外压迫所致。EUS可以在一定程度上弥补内镜技术的不足，有助于明确包块的形态特征，并进一步明确诊断［13］。然而，通过EUS或食管、胃、十二指肠镜检诊断GIST的准确性有待商榷［1］。对于怀疑小GIST的病人，行内镜(条件允许应加行EUS检查)联合增强CT可以提高诊断准确率，对于早期诊断小GIST至关重要［7］。近年有报道，明确GIST的诊断须行超声引导下细针穿刺［14］。但对于较易切除的小GIST，笔者不建议行穿刺活检，因GIST质地柔软易碎，活检可能导致瘤体破裂，增加肿瘤细胞医源性播散的风险。临床上根据需要，可联合形态学、免疫学（CD117和CD34）及基因学（KIT和PDGFRA）等多种检查手段明确诊断。《指南》推荐，对于最初怀疑为GIST的病人，应详细询问病史，同时根据需要，选择适当的检查，如增强CT（或联合MRI）、内镜（或联合超声内镜）、FDG-PET、EUS以及生化检测，如肝功能检查（LFTs）、全血细胞计数等［1］。笔者建议，无论选择何种检查手段，均应以病人为中心，根据病人的临床特征及个体化差异，选择最恰当的检查方式，以明确诊断，制定最佳的临床对策。
3小GIST的良恶性及危险度评价
鉴定小GIST恶性潜能对指导制定临床对策至关重要。临床上针对小GIST常呈自限性生长、大多无临床症状的特征，一般对策应为密切随访观察。相比于胃，位于十二指肠和小肠的小GIST病人更易发生出血等临床症状，此时须尽早干预治疗。对于存在高危EUS特征的小GIST病人，其危险度较高，建议积极干预治疗。Joensuu［15］对美国国立卫生研究院（NIH）危险度分级系统进行了修订，目前，对于局限性GIST危险度评估包括肿瘤原发部位（非原发于胃的GIST较原发胃的GIST预后差）、肿瘤大小、核分裂像以及肿瘤是否发生破裂等。Miettinen等根据对1600多例GIST病人的随访结果得出结论，对于核分裂像＜5个/50HPF的胃小间质瘤（直径＜2cm），可认为其是良性病变。《共识》指出，对于任何部位的原发肿瘤，核分裂像≤5个/50HPF的小GIST（直径≤2cm），危险度分级为极低，无术后复发风险，核分裂像为6个/50HPF~10个/50HPF的小GIST，危险度分级为中等；虽然核分裂像＞5个/50HPF的小GIST病例较少，但临床应视为可复发风险组，需定期随访观察［10］。而发生肿瘤破裂的小GIST，无论核分裂像多少，危险度分级均为高级别，术后复发风险极高。此分级系统提示：虽然绝大多数小GIST（直径≤2cm）生物学行为表现为惰性生长，不易进展，但是仍有少数小GIST具有恶性特征，危险度高，应给予足够重视。然而，此分级系统具有一定的局限性，此系统仅适用于原发GIST切除术后病人进行预后及复发评估，是否需增加术后补充治疗尚未评定；该分级系统亦无法用于术前评估GIST危险度。核分裂像的检测需要离体的肿瘤标本，而多数小GIST可完整切除，《共识》不推荐对此类小GIST术前进行常规活检或穿刺，且不适当的活检会引起肿瘤破溃、出血及增加肿瘤播撒风险；其次，内镜下活检常常难以明确病理诊断，因为只有少数GIST累及黏膜时才能取到肿瘤组织，且偶可导致肿瘤严重出血及播散［10］。《共识》增加《2010年版WHO消化道肿瘤分类》和《2013年版WHO软组织肿瘤分类》的6类8级标准，并根据预后分组将GIST分为良性、恶性潜能未定和恶性三类，作为“NIH危险度分级修订版”参考。
4小GIST的临床对策
《指南》建议对于GIST病人可采取多学科专家组（MDT）诊疗模式［1］。对于未发生并发症及肿瘤无转移的早期病人，一般不推荐进行MDT诊疗模式；对于发生并发症或肿瘤转移的进展期病人，推荐进行MDT诊疗模式。笔者认为，对于病情较复杂、诊断不明、病期较晚或临床医师在选择病人治疗策略发生分歧时，应启动MDT诊疗模式，根据GIST特点及病人个体化差异，选择最佳的策略。
4.1随访观察针对无临床症状、无高危EUS特征的小GIST，临床上一般采取密切随访观察对策，但对于无高危EUS特征的小GIST，长期EUS随访发现，仍有部分病人术后复发［19］。对于小GIST病人，有学者建议随访采取EUS检测或EUS联合增强CT检查的方案，随访频率为至少每2年1次。《指南》规定，对于直径＜2cm的胃小间质瘤，若不存在边界不规整、囊腔、溃疡、强回声及性质不均匀等高危EUS特征，应每6～12个月复查EUS。笔者认为，对于风险极低的病例，可降低随访频率；反之，风险增高，随访频率随之增高。《共识》与《指南》意见基本一致，对于小GIST，若EUS证实存在不良因素，如边缘不规则、溃疡、强回声和异质性，应考虑手术切除；否则，暂不手术，应每6～12个月复查EUS。
4.2小GIST的治疗
4.2.1内镜下治疗绝大多数小GIST起源于固有肌层，多呈外生性壁外生长，与周围组织边界较难判断，有时内镜下观察直径较小的肿瘤，实际外生部分较大，内镜下切除很难保证其切缘阴性，若切除过深过大又极易导致穿孔及出血，故行内镜下根治性切除术困难较大［20］。有学者指出，对于微小GIST病人应采取谨慎态度，在考虑行内镜切除治疗之前，必须充分告知病人风险［7］。《共识》指出，内镜下操作发生出血、穿孔和肿瘤种植等并发症的风险相对较高，不作为常规推荐［10］。目前关于内镜治疗后行EUS随访的策略仍存争议，Sun等［21］报道，内镜下治疗联合术后系统EUS随访，对于小GIST是一项既有效又安全的策略。笔者认为，对于经验丰富的内镜治疗中心，在保证手术安全性及根治性的基础上，可进行探索性尝试与临床试验，但是治疗后应制定系统的随访策略。
4.2.2外科治疗目前尚缺乏循证医学证据证实小GIST是否必须定期EUS随访，但有并发症发生风险或有症状者建议考虑手术切除［22］。《指南》建议，对于有高危EUS特征(边界不规整、囊腔、溃疡、强回声、性质不均匀)的小GIST病人应手术完整切除,术后3～5年内每3～6个月复查1次CT，之后每年复查1次；无高危EUS特征的病人每6～12个月复查1次EUS。《共识》指出，对于无症状的拟诊胃小间质瘤，若存在高危EUS特征，应考虑切除。临床医生应根据病人的个体化差异，选择最佳的外科治疗方式。
4.2.2.1腹腔镜手术治疗随着腹腔镜技术的不断推广和应用，越来越多的外科医师选择腹腔镜手术切除GIST，但目前GIST腹腔镜下手术仍处于探索阶段。有研究表明，腹腔镜GIST切除术具有复发率低、住院时间短以及病死率低等优点。《指南》指出，直径＜5cm的胃间质瘤可行腹腔镜手术切除。《共识》指出，腹腔镜手术一般可用于胃间质瘤的治疗，而其他部位GIST不推荐行腹腔镜手术治疗［10］。笔者认为，对于小GIST的腹腔镜手术，目前暂不适合作为常规推荐，但是对于腹腔镜手术经验丰富的医生，可根据部位和大小进行综合评定，确保术中无肿瘤破裂及瘤细胞播散的前提下，选择性地行腹腔镜手术治疗。
4.2.2.2传统开放手术治疗外科手术完整切除肿瘤仍是治愈小GIST的首选治疗方式，但具体术式应根据肿瘤部位及生长方式决定。由于手术的根治性与否与疾病的预后密切相关，因此，《共识》推荐行GIST病灶的整块完整切除［10］。手术切除应做到镜下切缘阴性（R0切除），同时应避免肿瘤破裂及出血等，积极降低术中造成瘤细胞播散的风险，在保证手术安全性的基础上，尽量保证肿瘤的根治性。多数胃小间质瘤可能伴随终生或自行萎缩退化，并不需要积极地外科干预。当胃小间质瘤有高危EUS特征或其恶性危险度较高时，应对其进行局部切除。《共识》建议，对于直肠小间质瘤，恶性程度较高，且肿瘤增大后保肛手术难度增加，倾向于早期手术切除［10］。对于小GIST，手术完整切除仍是主要手术方式。目前，尚无明确证据显示小GIST病人术后是否需要辅助药物治疗，虽然核分裂像＞5个/50HPF的小GIST病例较少，但临床应视为可复发风险组，需定期随访观察。
传统中国医学的系统决定着通过支队提取有效成分的方法，通过治疗的单一效果，对传统中药或者复方研究疗效进行评估，无法得到其本身所具有的本质属性。因此，传统中国医学的物理化学性质和生物活性，不单纯需要单一的药物与化合物，还需要进一步研究目标系统的反应规律之间的化学成分，以及人类的相关影响和协同的方法。在西方，研究中药的方法常常是拆迁测试，即通过解剖麻雀来发现活性成分的明显作用，但是却无法反映中药方剂在配伍方面的规则。因此，中国传统医学要想得到持续发展，不能仅仅局限在“全面”上，也不能单纯停留在提取活性成分的水平、纯化分离等层面，而是应该立足于中医理论，与研究现代生物医学的方法相结合，对于中国医药进行系统研究，以期建立起现代中医学理论体系。
传统中药复方充分体现了中医特有的整体观念和辨证治疗的整体理论，以君臣配伍理论为基础，通过药物的精选，全面调节平衡身体机能，发挥祛邪、标本兼治的功效。中国医药复方是传统中国医学的精华，传统中药的复合成分同人体之间呈现出复杂的非线性函数关系。中药复方的作用机理和整体评估兼容性的特性，必须要全面准确把握复合效应的整体性，传统中国医学与人体这两个复杂系统的相互作用，促成了一个更为先进系统的形成。传统中国医学理论只有在这一理念的指导下，与现代科学技术相结合，并发挥二者的相互作用，才能全面阐述中医的理论、作用机理以及治疗的物质基础。
传统中药复方具有对于各种有效成分进行协调的作用，针对器官、治疗目标、机体的生理和病理的不同，进行综合调控，发挥中药复方的综合作用。因此，研究传统中药复方应该从整体上进行，从而构建中国复合药品质量评价体系，这是很有必要的。因此，笔者基于化学基团理论，阐述复方中药的物质基础和分子作用机制，因为这样能够阐明兼容性的规则，有利于相应的中医辨证研究的开展。
Palmer等在人类上皮细胞应用siRNA技术沉默Tctex-1发现，出现了比对照组wt-Tctex-1更长的纤毛，此现象与运用同样方法沉默动力蛋白重链-2（DHC2）导致的初级纤毛延长相似，同时发现，抑制DHC2会引起Tctex-1的伴随损失。相比单个亚基的沉默，DHC2和Tctex-1用siRNA技术双沉默能导致更长的纤毛。早期的研究表明，DHC2与中间轻链LIC3（D2LIC）特异性相互作用参与初级纤毛的形成和功能，因此，证明Tctex-1是纤毛长度的关键调节因子，且该过程可能是通过Tctex-1动力蛋白依赖[25]性途径实现的。T94磷酸化Tctex-1连接纤毛重吸收与细胞重新进入S期过程，添加外源性Tctex-1（T94E）突变体能加速细胞纤毛吸收并促使其进入S期；然而，在非纤毛细胞中Tctex-1不能促使细胞进入S期。研究表[26]明肌动蛋白参与了Tctex-1调控纤毛吸收过程。在Tctex-1连接纤毛重吸收和细胞重新进入细胞周期的过程中，胰岛素样生长-1（IGF-1）磷酸化细胞纤毛的IGF-1受体（IGF-1R），进而活化AGS3调节Gβγ信号通路，随后招募磷酸（T94）Tctex-1选择性富集到纤毛过渡区，促有丝分裂信号转导使纤毛重吸收进一步加速G1-S期进程。在皮质区干细胞中干扰这一途径的任何环节都将影响神经元细胞增殖时的成熟分化。在大脑皮质（duringcorticogenesis）中，纤毛传导的非经典IGF-1R-Gβγ–phospho（T94）Tctex-1信号通路通过调节纤毛重吸收和细胞周期[13]G1期的长短进而促进神经干细胞的增殖和分化。此外，有报道证明食欲素（OX-A,OX-B）参与睡眠-觉醒周期的调节，Tctex-1与食欲素受体1（OX1R）[27]相作用，进而调节OX-A信号传导。据报道Tctex-1参与人瘤病毒等感染引起的肿瘤发生过程，同时，Tctex-1也参与抑癌基因REIC/Dkk-3的信号传导，Tctex-1表达下调削弱了其对GEF-H1的抑制作用从而引发白血病。
1．2教师对心理环境中师生关系的态度通过调查教师对延长工作时间为学习后进生提供帮助的看法以及教师对何种学生最适合实验教学的课堂为例展开对师生关系的调查分析。由图3可以看出67%教师对课后帮助学生补习实验予以精力范围内的支持，只有18%的教师认为要全力帮助学生。图4则可以看出63%的教师喜欢遵守纪律听话的学生，只有31%的教师认为在实验课堂上学生应该是态度积极、思维活跃的。
1．3教师自身对实验教学的准备和理解教师自身的理念和对实验教学的准备和理解也是心理环境的重要组成部分，直接会影响到实验教学的质量，笔者以实验教学中教师对实验的准备情况和一节高效率的实验课的决定因素为例展开调查。由图5可以看出36%的教师会精心准备实验课，但有30%的教师认为学校条件的限制影响了对实验的准备情况。图6可以看出77%的教师认为一节成功的实验课取决于师生的实验心理是否积极，师生关系是否和谐，只有23%认为是取决于硬件设施和时空环境。
2优化策略与建议
2．1教师应加强对学生消极实验心理的关注和优化研究教师应当充分意识到分析学生实验心理、端正学生实验态度对优化实验教学中心理环境的重要意义。首先教师要重视心理辅导，消除学生的恐惧心理，这也要求教师自身在实验操作过程中要从容不迫，给学生良好的榜样;另外有些实验过程可能耗时较长，这样学生可能就会对此失去耐心而产生抗拒心理等。所以教师可以尝试优化实验过程来培养学生的实验兴趣，从而将学生的注意力维持在一个较长的水平。
1.2lncRNA作为ceRNAlncRNA是一类长度大于200nt、由RNA聚合酶Ⅱ或Ⅲ转录、保守性较低的非编码RNA，并且其转录物可通过多种调节机制参与生物学过程。目前已发现超过10000种lncRNA可能具有潜在的ceRNA特性，许多研究已经证实lncRNA作为miRNA和mRNA的竞争平台，在病理和生理相关过程中发挥重要作用。研究发现，一些异常表达的疾病特异性的lncRNA通过ceRNA介导的相互作用在癌症的进程中产生深远影响。在对lncRNA-BGL3的研究中发现，其与PTEN竞争结合miR-17、miR-93、miR-20a、miR-20b、miR-106a和miR-106b，并影响PTEN的表达水平及其下游PI3K/AKT信号通路，进而影响Bcr-Abl的转化过程和肿瘤的生成。同样，lncRNA-HLUC在肝癌样本和细胞系中表达显著上调。对HLUC上调的多个机制研究中发现，其ceRNA特性是一个复杂的自动环路的一部分：HLUC作为分子海绵抑制miR-372的表达和活性，从而减少miR-372对cAMP依赖性蛋白激酶A催化亚基β（cAMP-dependentproteinkinaseAcatalyticsubunitβ,PRKACB）的抑制作用，而PRKACB能诱导cAMP反应结合蛋白（cAMPresponseelementbindingprotein,CREB）的磷酸化，在肝癌中提高CREB依赖的HULC表达上调。这些研究表明，lncRNA作为ceRNA在相关信号通路和环路中发挥作用，影响癌症的进程。除了在癌症进程中的作用，lncRNA亦可作为ceRNA在一些生理过程中发挥重要作用。如内源性lncRNALinc-MD1以ceRNA的方式调控肌肉分化的过程。Linc-MD1能分别结合miR-133和miR-135，从而与它们的靶基因——决定因子样蛋白-1（Mastermind-likeprotein1,MAML1）和肌细胞特异性增强因子2C（Myocyte-specificenhancerfactor2C,MEF2C）产生竞争性效应。在对另一个lncRNA——H19的研究中发现，其不仅作为let-7的分子海绵调节let-7的表达，而且使let-7的靶基因HGMA2和Dicer在蛋白水平表达上调。由于let-7的表达通常与细胞的分化状态相关[，在小鼠肌源性细胞C2H2中的研究中发现H19的缺失与过表达let-7产生的效果一致，均可显著增加肌球蛋白重链(Myosinheavychain,MHC)和肌细胞生成素（Myogenin,MyoG）的表达，从而加速肌肉分化。以上lncRNA作为ceRNA在肌肉分化中的作用说明lncRNA以ceRNA角色参与生长发育调节，也可能在其他生物学过程中发挥作用。
1.3CircRNA作为ceRNACircRNA是一类由特殊的选择性剪切产生的非编码RNA，与线性RNA不同的是：circRNA呈封闭环状结构，不受RNA外切酶的影响，表达更稳定。研究表明，某些特殊的circRNA分子富含miRNA结合位点，在细胞中起到miRNA海绵的作用，进而解除miRNA对其靶基因的抑制作用，升高靶基因的表达水平，是一类高效率的ceRNA[34]。如小脑变性相关蛋白1反义链（Cerebellardegeneration-relatedprotein1antisense,CDR1as）包含63个保守的miR-7结合位点，该circRNA在细胞中和miRNA效应物密集地结合，能有效地解除miR-7对其靶基因的抑制作用，升高靶基因的表达水平。在斑马鱼(Daniorerio)模型中（本身不表达CDR1as），表达CDR1as与敲除miR-7有类似的效果，都能损伤斑马鱼中脑的发育。研究发现，miR-7作为关键调节因子广泛参与癌症途径，如抑制在乳腺癌、胶质瘤等癌症中表达显著上调的信号激酶P21激活激酶1（P21-activatedkinase1,Pak1）的表达；miR-7也能通过作用α-突触白（α-synuclein）编码的mRNA3′UTR，抑制其表达。这些研究暗示CDR1as因其ceRNA特性能有效地吸附miR-7，可能是神经元功能的调节因子，也可能是神经系统疾病和癌症治疗的潜在靶点。Capel等对另一个已知环状RNA性别决定区域Y(Sex-determiningregionY,Sry)的RNA研究发现，该RNA含有16个miR-138的结合位点，利用靶点分析实验和免疫共沉淀实验证实该环状RNA能作为miR-138的分子海绵，抑制miR-138的表达。同时，Granados-Riveron等进一步研究发现Sry的正义链转录物和其反义链转录物类似，也能发生环化并作为miR-138的分子海绵起作用。目前结合最新生物信息学工具和相关实验技术在基因组中发现成千上万种circRNA在特定组织或特定发育阶段稳定表达，这暗示circRNA在基因组中的含量很丰富，并非RNA选择性剪接产生的随机物，它在一定程度上可能参与基因的表达调控。如利用RNA转录组测序（RNAsequence,RNA-seq）数据分析果蝇circRNA的生物合成和功能，发现其circRNA上含有大量保守的miRNA结合位点。结果显示circRNA作为潜在的高效ceRNA分子，对其进一步的生物学功能研究具有重要意义。以上非编码RNA作为ceRNA及其生物学功能见表2。
2ceRNA的调节
目前，许多研究已表明ceRNA之间的相互作用，但对于哪些因素可能会影响某个RNA分子发挥其ceRNA功能仍不清楚。我们推测构成ceRNA调控网络的各个组分的数量级、RNA3′UTR的变化以及RNA结合蛋白（RNAbindingprotein,RBP）的作用都有可能对ceRNA构成的调控网络产生重要的影响。
2.1ceRNA、miRNA和MRE的数量ceRNA和miRNA的表达水平会影响ceRNA网络的交互作用。当总的转录物数量远远超过miRNA数量时，整体的ceRNA关系很弱，因为只有数量有限的miRNA起抑制作用。相反，当miRNA的数量远大于ceRNA分子数量时，交互作用不太可能发生，因为转录物都处于被抑制的状态。因此，交互调节可能发生在一个所有ceRNA和miRNA数量在近似数量级的网络中。Kumar等利用RNA-seq分析得到HMGA2和TGFBR3的转录物表达水平相似，并且共同结合的let-7家族成员的总表达水平与HMGA2和TGFBR3的表达水平在一个数量级，这进一步用实验证明最佳的ceRNA对话可能发生在miRNA与ceRNA转录物丰度一致的情况下。此外ceRNA间共同的MRE数量也会影响ceRNA调节。为了验证这一假设，Ala等[44]构建了一个实验模型：该模型由10个ceRNA和10个miRNA共同组成，但并不是所有的ceRNA都能被这10个miRNA作用。研究发现，当增加其中某一个特定ceRNA表达时，含有更多MRE的RNA表达会显著上升，而对于不含有共同MRE的其他RNA则几乎没有作用。由此说明单个RNA所含MRE的数量也可能决定其在ceRNA调控网络中的作用。
2.23′UTR的变化目前对于ceRNA的研究主要是基于miRNA作用于RNA的3′UTR而引发的分子间竞争所导致的相互调控。因此，RNA分子3′UTR的变化会影响ceRNA调控。研究发现，RNA剪接和聚腺苷酸化这两个过程会影响RNA的3′UTR。RNA的剪接会影响分子的稳定性也会减少或增加3′UTR上miRNA的结合位点，聚腺苷酸化常使编码基因转录出更短的3′UTR。对于3′UTR变短的转录物，一方面，直接靶向它的miRNA会减少；另一方面，它作为ceRNA调节其他转录物的能力也将减弱。Mayr等在研究中发现，3′UTR变短的转录物上一些miRNA的结合位点消失。miRNA既可以使mRNA降解，也可以抑制mRNA的翻译。在不同组织和基因间的实验发现，3′UTR变短的转录物的稳定性更强，并且编码更多的蛋白质。因此，无论是3′UTR上序列的变化还是长度的变化，都可能影响ceRNA发挥其功能。
2.3RBP与miRNA间的相互影响RBP在许多转录后过程中起着重要作用，包括影响RNA剪接、稳定性、转运和翻译。RNA间除了相互竞争共同的miRNA，也可能竞争共同的RBP。这两个调节过程可能不是分开的，它们之间也存在着内在的联系[17]。RBP不仅与miRNA通过竞争或合作结合特异性位点影响它们靶向的mRNA表达，还可能由于RBP的结合导致RNA二级结构的改变，从而改变了miRNA的结合位点。由于RBPHuR发现得较早，在这方面的研究较多。研究发现RBPHuR和miRNA之间的竞争通常能增强基因的表达，如HuR分别与miR-122、miR-548c、miR-494、miR-16和miR-331-3p竞争结合阳离子氨基酸转运蛋白1、拓扑异构酶Ⅱα(TopoisomeraseIIalpha,TOP2A)、核仁素（Nucleolin,NCL）、环氧合酶-2（Cyclooxygenase-2,COX2）和ERBB2的mRNA，抑制相应miRNA作用于这些mRNA，从而促进mRNA合成；而HuR和miRNA间的结合通常降低它们靶向mRNA的表达，如HuR能作用C-MYCmRNA3′UTR，上调其表达，但当HuR与let-7的RNA诱导的沉默复合体（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC）作用时，会抑制C-MYC的表达[56]。上述研究说明，RBP可能通过与miRNA相互影响，进而在ceRNA网络产生影响。
1．2肝细胞标志基因的检测按照总RNA提取试剂盒的操作说明分别提取hUC-MSCs和人肝癌细胞HepG2的总RNA，用RNase-FreeDNaseⅠ去除基因组，最后检测RNA的浓度和纯度，立即进行反转录合成cDNA或保存于－80℃备用。采用Prime-ScriptTMⅡHighFidelityRT-PCR试剂盒反转录2μgRNA得cDNA，取2μL用于PCR。根据GenBank提供的人肝细胞标志基因序列，使用PrimerPremier5．0软件设计引物，引物序列和产物大小见表1。GAPDH为内参对照。PCR反应条件:94℃预变性5min;94℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸30s，30个循环;最后72℃延伸5min。PCR产物用20g/L的琼脂糖凝胶电泳，在凝胶分析系统下拍照。
1．3PAS糖原染色按照PAS染色试剂盒的说明书操作，对第5代hUC-MSCs和HepG2进行糖原染色，在倒置相差显微镜下观察并照相。
2结果
2．1hUC-MSCs的分离、培养、传代及鉴定组织块贴壁培养3～4d时，可观察到组织块间隙铺展出小三角形或长梭形的细胞，继续培养至7d左右，可观察到局部细胞呈集落生长，此时，在无菌条件下取出组织块，更换新鲜培养基，继续培养1周左右，细胞可达80%～90%汇合，即可传代。用胰酶/EDTA消化后细胞呈亮而圆的单个分散状，以1∶3的比例进行传代，约4h贴壁，2d后迅速生长。倒置相差显微镜下可观察到细胞较大，轮廓清楚，内部有清晰的应力纤维，多为突起的纺锤形或星形的扁平状结构，细胞核呈规则的卵圆形，核仁大而明显，呈典型的成纤维细胞样形态(图1A);持续培养大约2周时，细胞基本达到完全汇合，形态发生一定的变化，胞质变得狭窄，内部的应力纤维也不明显，呈平行排列或漩涡生长(图1B)。连续多次传代，细胞保持稳定的、相对均一的成纤维细胞样形态以及较强的增殖能力。经鉴定分离培养的细胞CD44呈阳性表达，且具有良好的均质性。
2．2肝细胞标志基因的表达以HepG2作为阳性对照，用RT-PCR检测hUC-MSCs的肝细胞标志基因的表达情况，结果见图2，hUC-MSCs表达ALB、CK18、G6P、GLUL和MET，不表达TAT。
2．3PAS糖原染色结果对hUC-MSCs和HepG2进行PAS糖原染色，染色结果显示两种细胞的细胞质中均有紫色颗粒物形成，即均呈糖原阳性反应(图3)。
3讨论
MSCs能分泌多种细胞因子和生长因子，具有直接或间接的抗炎及抗纤维化作用，可抑制肝细胞的死亡和纤维化;还可通过其分泌物抑制肝细胞的凋亡、刺激肝细胞再生、为受损肝细胞提供营养支持等。MSCs还具有低免疫原性及免疫抑制力，适用于进行同种异体移植，在移植后可迁移、归巢至受损的组织，发挥治疗作用。因此，MSCs在肝脏疾病的细胞移植治疗中具有广阔的应用前景。研究发现，相较不同来源的MSCs，脐带来源的MSCs不仅具有干细胞的特性，而且来源丰富、取材方便、增殖能力较强、无伦理法律限制，还具有较低的免疫原性和分化程度，从而成为一个非常有吸引力的移植治疗肝病的细胞来源。
2结果与分析
2．1病原菌生物学特性观察
2．1．1温度和pH值影响
试验结果看出，在PDA培养基上槟榔炭疽菌菌丝生长的温度范围是10～40℃，最适生长温度25～30℃，低于5℃或高于40℃均不能正常生长。该菌在15～30℃均能产孢，最适产孢温度25℃，产孢量最多。pH值4～11时槟榔炭疽菌在PDA培养基上均能生长和产孢，菌丝最适生长pH值6～7，pH值大于4的条件适宜产孢，pH值＝6产孢量最大（见表1）。pH值对菌丝生长和产孢的影响一致，酸性偏碱的条件适宜病菌的生长和产孢。
2．1．2不同碳源、氮源的影响
试验结果看出，不同碳源培养基上，槟榔炭疽菌菌落生长及产孢量明显不同。7种供试碳源的菌丝生长均优于对照，除D－半乳糖外，其他碳源的菌落直径均大于对照，说明碳源对槟榔炭疽菌菌丝生长具有促进作用。海藻糖的菌落直径最大，长满整个平板，且菌丝生长旺盛；其次为可溶性淀粉，菌丝生长茂密。碳源对槟榔炭疽菌的产孢量影响差异较大。除可溶性淀粉、D－果糖、甘露醇的产孢量大于对照外，其他供试碳源的产孢量均低于对照。可溶性淀粉的产孢量最大，D－果糖次之。8种供试碳源中，可溶性淀粉适合槟榔炭疽菌生长和产孢，可作为槟榔炭疽菌的培养碳源。不同氮源对槟榔炭疽病菌菌落生长及产孢的影响差别较大。以硝酸钾和脲为氮源时，菌落生长最快，菌丝生长旺盛，且产孢量也最大；硝酸钠培养基的菌落生长旺盛，但不产孢。以硫酸铵、氯化铵、硝酸铵为氮源的菌丝生长及产孢均明显受到抑制。在无氮培养基上，菌落直径最大，但菌丝极少，接近透明且不利于产孢（见表2）。
2．2杀菌剂的抑制作用
试验结果看出，6种杀菌剂对槟榔炭疽病菌菌丝生长的抑制作用差异较大（见表3，图1）。咪鲜胺抑制作用最强，其次为苯甲•丙环唑，代森锰锌、十三吗啉的抑制作用较弱，不适用于防治槟榔炭疽病；甲基托布津、多菌灵对槟榔炭疽菌基本上无抑制作用，不能用于防治槟榔炭疽病。
医学细胞生物学是一门以细胞生物学和分子生物学为基础，探索研究人体细胞发生、发育、增殖、衰老、死亡以及细胞结构与功能的异常与人类疾病关系的学科［1］。医学细胞生物学是临床医学、检验医学、口腔医学、预防医学等医学专业的一重要基础课，同时也是生理学、病理学、免疫学、组织胚胎学、药理学等医学基础课程以及后续临床课程的基础［2］。学习医学细胞生物学的基本理论知识有助于医学专业学生从分子细胞层面理解人体生命活动规律和疾病发生发展进程，为专业课学习和后续的科研工作奠定坚实的理论基础［3］。医学细胞生物学是一门实验操作性极强的学科，实验教学是这门课程教学工作中的重要实践环节，在培养学生动手能力、实践探索能力和科学创新能力等方面具有重要作用［4-6］。传统的教学理念和教学方法已经不能满足新时代的需要，如何能在有限的时间内，让学生系统掌握医学细胞生物学的基础理论知识，并熟练掌握基本实验操作技术，是新形势下医学细胞生物学教学改革的一项重要内容［7-8］。本文结合郑州大学基础医学院的实际情况，对医学细胞生物学理论课及实验课教学中存在的问题及改革策略进行探讨并提出建议，以提高医学细胞生物学教学质量。
1提高医学细胞生物学理论课教学质量的建议
1．1理论课教学内容的改革
首先，针对不同专业，因材施教。临床医学、检验医学、法医学、临床药学、预防医学等专业均需要开设医学细胞生物学。任课教师应该结合教学大纲并根据教材内容，为不同专业的学生制定相应的教学计划和授课内容，按照学校的课程设置，多方面、多角度、多层次因材施教，提高医学细胞生物学的课堂教学效果。其次，注重基础理论，由浅入深。注重教学内容的基础性，构建并完善由细胞基本结构及其功能、细胞重大生命活动现象及本质等所组成的理论教学体系，加强学生对基本理论知识及基础实验技术的理解。授课教师应该以真核细胞的结构与功能为教学重点，使学生对细胞的主要结构及其功能等有系统、全面的了解和认识。然后，精炼教材内容，突出重点。医学细胞生物学课程的内容较多，但课时有限，所以，任课教师应精炼教材内容，有的放矢授课。该门课程的必修内容是认识人类自身生命活动的基础，也是认识疾病发生、发展的理论基础。授课教师在授课过程中要注意精练授课内容，突出重点章节，同时，课后需要对本节课的内容进行归纳总结。
1．2理论课教学方法的改革
首先，使用启发式教学。授课教师应该在课堂上开展启发式教学，实现教师与学生的课堂互动。启发式教学相比传统单纯由教师讲课的教学方式更具有优势，可以更加有效地激发学生的学习兴趣。启发式教学不但注重知识的传授，更注重能力培养，因此，启发式教学可提高学生的思维能力和创新能力。其次，使用多媒体教学。医学细胞生物学课程中有很多细胞结构图和分子机制图需要制作成动画，以使复杂抽象的内容变得直观有趣，调动学生的学习主动性，增强学生的学习兴趣。同时，任课教师可以充分利用网络资源，搜集医学细胞生物学的视频课件资料并运用到课堂教学中。这样既可以拓展学生的学术视野，又可以提高学生的综合素质。然后，使用案例式教学。案例教学是在事实案例基础上的一种开放式、互动式的新型教学方式。医学专业学生不仅要掌握细胞的结构、功能，还应该熟悉细胞的病理改变与疾病发生发展的关系。但是由于医学细胞生物学课程的理论性强、内容抽象，所以任课教师应该积极探索案例式教学，以激发学生的学习兴趣，提高医学细胞生物学的教学质量。
1．3理论课考试方式的改革建议
首先，优化考试内容。任课教师可以通过以下几点优化理论课程的考试内容:(1)建立和完善理论课程的考试题库，保证理论课程考试的有效性;(2)根据本院开设的临床医学、检验医学、预防医学等专业设置相对应的考试题目;(3)指导学生撰写综述性论文或科研标书，以培养医学专业学生良好的思维能力和创新意识。其次，优化考试形式。任课教师可以通过以下方法优化理论课程的考试方式:(1)构建综合丰富的考试方式。建立平时成绩和期末考试成绩相结合的考试体系;(2)增加创新能力考试的比重。任课教师让学生按照要求写出科研标书并进行打分;(3)增加平时表现考试的比重。平时表现考试主要是在课堂上对学生回答问题的情况予以评分并记录。然后，优化评价方案。任课教师可以通过调整期末闭卷考试及平时表现考试优化评价方案。理论课考试中的期末闭卷考试成绩占理论课总成绩的70%，试题从考试题库中随机抽取。同时理论课考试中也包含学生的平时成绩，这一部分占总成绩的30%，包括学生的出勤情况、课堂上回答问题的情况以及学生完成综述性论文的情况。
2提高医学细胞生物学实验课教学质量的建议
2．1实验课教学内容的改革建议
首先，优化实验教学大纲。由于受到课堂学时及硬件条件等方面的制约，很多院校的医学细胞生物学课程的实验课内容仅仅局限在一些验证性和基础性的实验。任课教师需要调整教学内容，增开一些与理论课程密切相关并且与学科前沿紧密联系的综合设计实验。这样可以激发学生的学习兴趣，更好地发挥学生的积极性和主观能动性。其次，培养学生创新能力。任课教师可以在基础性实验之外开设一些探索性及创新性较强的综合实验，例如细胞融合实验、细胞凋亡实验、细胞免疫组织化学实验和免疫荧光实验等。培养并提高学生的实际操作能力以及分析问题和解决问题的能力，使学生初步具备进行设计性实验的能力，提高学生的科研素质和创新能力。然后，设置开创综合实验。任课教师应当结合理论课内容及相关临床应用，修改完善实验课教学大纲，科学设置实验内容，培养学生的实验操作能力，以增强学生的科研兴趣为重点，在实验课教学中适当增加一些开放性强且创新性强的综合实验，让学生运用已掌握的知识与技术进行更深入的研究设想，培养独立科研工作的能力。
2．2实验课教学方法的改革建议
首先，应用启发式教学。与传统的实验课教学相比，在启发式的实验课教学中，任课教师应该在讲解实验目的和原理后，鼓励学生根据所学的知识设计实验过程，然后分析研究最后得到的实验结果以探索实验原理。采用启发式教学可以培养学生的思维能力，引导学生积极思考，启发学生从不同的角度考虑问题，期提高学生的综合科研素质。其次，使用多媒体教学。在医学细胞生物学的实验课教学中，多媒体技术的应用能够极大地方便课堂教学工作。多媒体教学形象生动、易于理解，可以方便地解决一些不容易讲解或者难以开展的实验。另外对于某些受条件所限而不便亲自操作的实验，学生可以观看教学演示片，全面了解这些前沿实验仪器的结构、性能和用途。然后，开展研究型教学。医学细胞生物学的实验课程与科研工作相结合可以提高学生的学习兴趣和科研热情。任课教师在实验课堂上采用开放式的研究型教学可以激发学生的求知欲，让学生学会分析问题和解决问题。开放式研究型的实验课教学，让学生经历严格的科研训练，为以后申报、参与以及实施各种创新性科研项目奠定基础。
2．3实验课考试方式的改革建议
首先，优化考试内容。为全面、科学地考察学生的实际动手能力以及科研创新能力，改革后的医学细胞生物学实验课的考试内容应该以核学生的实验操作水平为主，以考试学生的理论知识水平为辅。这种改革模式，可以培养学生在实验操作过程中分析问题、解决问题的能力，并拓宽学生对实验操作技术在临床应用中的思考。其次，优化考试形式。建立完善的成绩评定体系是保证实验教学质量的关键。实验课程的考试应是一个全方位、多角度、全时段的综合评测，包括平时课堂考试及综合实验考试，平时课堂考试包括出勤情况、课堂回答问题情况和实验操作情况、实验报告完成情况，综合实验考试包括实验理论考试、实验操作考试、开放性及探索性实验考试等。然后，优化评价方案。实验课的考察应该以考察学生运用实验技术的能力为主，包括以下几点:(1)考察学生的平时成绩，包括出勤情况、实验报告完成情况等，占实验课总成绩的20%;(2)考查学生的理论水平，包括实验基本原理、实验技术手段、实验操作方法等，占实验课总成绩的20%;(3)考察学生的实验操作，占实验课总成绩的60%。综上所述，医学细胞生物学的教学是教师与学生共同学习、教学相长的过程。在这个过程中，首先任课教师需要不断提高自身素质，认真做好科研工作并积极学习本课程最先进的理论知识与最前沿的实验技术。其次，任课教师也需要精心把握课程内容，不断总结教学经验，比较各种教学方法的优劣，并将各种教学方法有机结合、交叉运用。同时，任课教师可以根据学生的不同专业方向，改进传统教学模式中教案和课件的内容，在上课时适量引入案例教学，从而调动学生的学习兴趣，提高学生的综合素质。另外，任课教师也需要加强实验课教学的比重，改革实验教学内容，完善实验教学条件，采用多种教学手段，建立完善评价体系，并不断探索研究新实验，使实验课堂更富有学术气氛。以上这些举措是提高医学细胞生物学的教学质量，培养适应现代社会发展的具有较强的综合能力和科研素质，具有独立发现问题、思考问题、分析问题及解决问题能力的创新型医学专业人才。
作者:郑皓 单位:郑州大学基础医学院医学遗传与细胞生物学系
参考文献:
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［2］丁童．医学细胞生物学本科教学特点与教学模式改革［J］．基础医学教育，2013，15(6):559-560．
［3］蔡丽希，陈小萍，许桂芬．医学细胞生物学课堂教学模式创新研究与实践［J］．赣南医学院学报，2014，34(5):696-697．
［4］付燕燕，陈彦，吴健，等．医学细胞生物学实验教学改革的几点思考［J］．基础医学教育，2015，17(2):135-136．
［5］唐历波，李栎，肖憬．临床专业医学细胞生物学实验课程改革的几点建议［J］．治学之法，2014(6):178-179．
2灵活多样，结合临床，增强学生的主观能动性
教学方法的选择应根据不同的认知对象、不同的学科、同一学科的不同内容从而选择不同的方法，但不管采取何种教学方法，关键在于把课上活，充分调动学生参与教学的积极性。因而根据教学内容的不同，我们采取了多种教学方法。如对于细菌的形态和结构这一章节内容，采用直观的多媒体教学可以让学生形象地看到各种细菌的形态、基本结构及特殊结构;在细菌各论部分，选取部分教学单元由学生自主教学。教师事先根据教学目的、教学内容提出授课提纲、学习重点及难点并确定人员分组。小组成员细致分工、相互协作，在课后完成资料素材收集及教学课件的准备。在此期间，教师与学生进行充分沟通，及时为学生排疑解惑，引导学生在教学大纲的框架下安排课堂讲授内容，并传授讲课技巧及注意事项。同时设计《学生自主学习实践评价标准》，由学生从教学内容安排、课件制作、语言表达等多方面互相进行评议、分析和总结，教师最后进行点评总结。这种教学方式一方面活跃了课堂气氛，加深学生对所学知识的理解，增强了学生的团队意识，另一方面也可以让教师在与学生的互动中、从学生独特的视角中发现许多平时不会思索的问题;在学习引起人类疾病的常见病毒这一部分内容时，采取专题讨论方式进行学习。专题讨论式学习由教师提出专题，分组学生在本专题内提出应深入讨论的问题，查资料，作综述，课堂进行讨论。例如“人类免疫缺陷病毒”的讨论式教学，学生提出一系列问题，如HIV－1感染的分子机制及免疫反应、T细胞功能受损的疾病、HIV疫苗的研究等，经过讨论，不仅全面完成了教学内容，而且为学生提供了一次“综述训练”的机会，教学效果令人满意。此外，作为一门与临床学科关系十分紧密的基础课程，我们在教学过程中十分注重微生物学知识的临床应用，采用PBL教学法将临床病例分析引入课堂讨论教学，由病引入菌，菌中解析病，菌病结合，解除病菌。如此，在整个讲授过程中就将病原微生物的生物学特性、致病物质与致病机制、检查及防治原则讲解清楚。
3反映前沿，开阔视野，培养学生创新能力
在教学过程中，既要将教材中最基本、最核心的理论知识传授给学生，为学生自主学习打下坚实的基础，同时要补充一些开拓性、时代性和应用性较强的学科前沿内容。如微生物的耐药性这一章节，我们为学生播放与耐药机制相关的视频和短片，引导学生就微生物耐药机制的产生及防控进行积极的讨论，鼓励学生查阅耐药机制最新的高质量学术论文并就学习心得进行讨论交流，取得了良好的效果。此外，在授课过程中结合教研室老师的科研方向，为学生讲授该领域的研究进展，如人体微生态学与免疫性疾病的相关性研究进展、新出现的传染病病原体、流行性感冒病毒的研究进展等教材中鲜有介绍的前沿动态，从而启迪学生思维，拓宽学生的知识面。同时鼓励学生积极参与教师的科研课题，通过进行科学实验研究进一步激发学生学习微生物学的兴趣及爱好，培养学生发现问题、解决问题的能力和创新能力，全面提高学生综合素质。
病原生物学包含医学微生物学与人体寄生虫学2门相关学科，是医学人才培养课程体系中一门重要的专业基础课川。实验课是病原生物学教学的重要组成部分，实验教学的质量直接影响着这们课程的整体教学效果。传统的教学模式中存在重理论讲授、轻实践操作的现象。学生缺乏动手能力和开拓创新精神，很难适应素质教育的需求。我们经过长期的教学实践，深切的体会到只有强化病原生物学实验课各个环节，采用经典与创新结合的教学方法，传统与现代并用的教学手段，才能有效地提高教学质量。
一、实验教学内容的优化、改革
根据专业培养目标和学科发展的要求，制定实验教学大纲和教学计划，编写实验教材、优化教学内容，注重培养学生的综合能力，改革单调的演示验证性实验。逐步开设综合性、设计性实验，激发学生创新意识，锻炼、培养学生独立操作及分析和解决问题的能力。
二、培养学生严谨求实的科学态度及作风
每次实验课前，首先让学生充分预习实验内容，实验过程中教师应帮助学生建立“有菌观念”，养成“无菌操作”的良好习惯。及时纠正错误，规范实验操作，实验课上一定要强调“眼见为实，实事求是”的重要性，强调实验结果的准确性。对于实验报告中抄袭实验讲义，编造实验结果，不讲求实事求是的现象要予以严肃批评教育，同时也和未获得预期结果的学生一起探讨原因，营造切磋研讨，教学相长的机会和氛围。在实验教学中潜移默化地培养学生求精敬业的医学职业道德，为以后科研及临床工作奠定良好的基础。
三、强化技能训练
实践技能训练是培养学生综合能力最有效的途径，我们在强化技能训练的同时，将能力培养和态度培养贯穿于实践教学的始终。如显微镜油镜的使用、革兰染色法与抗酸染色法操作、细菌的培养与鉴定技术等。对锻炼和培养学生的精细动作，细致的观察力及一丝不苟、精益求精的工作态度等都极为重要。通常一个完整的实验过程，涉及实验设计、操作步骤、结果观察、报告书写等方面，教师要充分利用实验教学过程中的每一个环节，切实加强学生综合能力的培养。
四、培养学生动手操作能力
4.1明确实验目的首先向学生阐述实验目的，鼓励其亲自动手，独立操作。
4.2将社会实践融人到实验教学中在教学过程中，针对一些常见病原性疾病的实验诊断方法进行相关实验诊断和检测。如学生应用透明胶带法自行检查蠕形蜡感染;应用粪便生理盐水涂片法检查蠕虫卵;应用酶联免疫吸附试验等方法对自身血清中的乙型肝炎、丙型肝炎抗原、抗体进行检测。因为这些实验都是检测自己的感染情况，所以学生实验操作都非常认真，实验过程中既掌握了操作技术，又深刻体会了实验技术在临床实际工作中的应用，同时学生在实验中对自身的健康状况又有了进一步的了解，极大地激发了实验兴趣。
4.3发扬团队协作精神对部分需要多人共同完成的实验，实行小组长负责制，实验小组成员之间相互协作，密切配合，要求在最短的时间内完成实验，训练学生的组织能力和团结协作能力。
五、充分利用多媒体教学手段。提高实验教学效率
多媒体教学是将文字、图形、动画、视频、声音等多种信息加工组合在一起来呈现知识信息。多媒体突破了微观限制，帮助学生加深理解教学内容，将不易单纯用语言表达清楚的抽象复杂的理论直观地表现出来，变抽象思维为形象认识，使教学内容生动形象。病原生物学实验有一些内容以模式图和实物标本难以展示，应充分运用现代计算机多媒体进行辅助教学，激发学生的求知欲望和实验兴趣。比如在讲解用悬滴法进行细菌的动力测定时，学生经常无法找到正确的视野，除了显微镜使用原因之外，更多的是学生对细菌运动没有直观的认识。为此，我们特意制作了常见细菌的动力学观察视频资料，学生在短短的几分钟时间内对细菌的运动和显微镜的使用便有了初步的认识，操作和观察效率大为提高，激发了学生自主学习兴趣，教学效果也有了显著提高。
山药又称淮山、山薯、薯蓣、大薯，原产亚洲热带地区。我国南北各地均有栽培，以地下肉质块茎供食，喜温暖湿润，忌积水，怕干旱。山药为中药、蔬菜兼用，营养丰富，含有大量淀粉及蛋白质、B族维生素、VC、VE、葡萄糖、粗蛋白氨基酸、胆汁碱、尿囊素等。作为中药可以健脾益胃、助消化、滋肾益精、益肺止咳、降低血糖、抗肝昏迷、延年益寿。一般产值9万元/hm2左右，与其他作物进行周年间作套种产值可达15.0～22.5万元/hm2。
1生物学特性
山药为多年生缠绕草本植物，茎细长，叶对生或3叶轮生，1m以上，叶片心脏形或箭头形，叶腋间常生1个珠芽（气生块茎），亦称零余子（山药蛋），可用来繁殖和食用。地下肉质块茎，分为棍棒状、掌状和块状3类，表皮粗糙呈淡黄褐色或黑褐色，表面密生细须根，春季自块茎上生不定芽，肉白色或淡紫色。夏季开花，花单生，乳白色少有结实，都行块茎繁殖。雌雄异株，穗状花序，雌花序下垂，雄花序直立，花小，黄绿色。果实有三棱，呈翅状，成熟后枯黄色。山药要求高温，干燥气候，块茎10℃开始萌动，生长适温为25～28℃，在20℃以下生长缓慢，叶蔓遇霜则枯死，短日照能促进块茎和零余子的形成。
2高产栽培技术
2.1品种选择
当前栽培的山药品种主要有2类：一是普通种，通常又叫家山药，二是大薯又叫田薯。目前栽培的主要品种有淮之、农大短山药1号等。
2.2土地选择
选择地势高燥、排水良好、土层深厚、松软的沙壤土或壤土田块，要求上下土质一致，如下层有较薄的黏重土层，挖沟时挖去，也可种植。土壤以微酸到中性为宜。山药不能连作，一般应隔3年轮作1次。
2.3种子处理，培育壮苗
应采用零余子（俗称山药蛋、山药豆）和山药块茎段作种。种前需晒种1周以上，促进种子内部物质的转化，打破休眠，杀灭种子表面的病菌。零余子晾晒至表皮呈灰绿色，上面有很多疙瘩突起，用手剥开表皮可见紫绿色的肉。山药块茎段晾晒至伤口向内萎缩，并从断面中间裂开。4月上中旬选择较肥沃的土壤掺以腐熟农家肥进行集中催芽育苗，可采用10cm×20cm的窝行距，待苗高10cm左右便可移植大田。
2.4栽植
挖沟栽植时，首先把沟内20cm深的熟土取出放在沟两边，沟宽30cm，再继续将沟下40cm深的土层挖松，将拌匀的腐熟农家肥15.0～22.5t/hm2、磷肥750kg/hm2、碳铵450kg/hm2、硫酸钾375kg/hm2施入其上，并稍加翻挖，最后把沟两边的熟土提到沟上，培成宽30～35cm、高20cm的土垄，再将繁育好的山药苗栽植在土垄上。一般栽4.5～7.5万株/hm2，水肥条件好，密度宜小。为了便于搭架、田间管理和通风透光，宜采用宽窄行相间栽植，如100cm×70cm×25cm，栽4.65万株/hm2；或80cm×50cm×25cm，栽6万株/hm2。
2.5常见的栽培模式
常见的栽培模式有：韭菜与山药套种、玉米与山药间套种、蚕豆与山药套种等模式。蚕豆与山药套种，一般在10月底11月初整地点蚕豆，来年3月到4月收蚕豆栽山药，效益可达15万元/hm2；韭菜与山药套种，效益可达18万元/hm2；玉米与山药间套种高效立体栽培，周年可生产蔬菜，效益更高，可达22.5万元/hm2以上。
2.6喷施生长调节剂，控徒长，促高产
多效唑对山药藤蔓生长具有明显的抑制作用，表现为节间缩短、藤蔓粗壮、叶色浓绿、叶片增厚、顶端新生侧枝减少、花蕾发育不良、零余子生长受抑，能使山药增产10%以上。喷施多效唑的最佳时期在山药藤蔓满架，现蕾开花初期，均匀喷施15%多效唑可湿性粉剂1000～1500倍液，生长过旺的田块可多喷1次，间隔1周。
2.7搭架通风透光
山药是藤本右旋攀缘性植物，任其自然生长不利于通风透光和产量提高。搭“人”字架应在藤蔓生长到50cm以上进行，支架顶端用架材连接，并用绳子扎牢，以提高支架的撑力和抗风能力，防止倒架。搭架能改善通风透光条件，提高植株中下部叶片的光合作用能力，降低架内的湿度，减少病害，从而提高山药产量。一般架高在2m左右。
2.8重施钾肥，促进块茎膨大
山药喜有机肥，从播种到发棵都可铺施。在生长前期以藤蔓生长为主，应适当供应速效氮肥，进入块茎生长旺期，要重视氮、磷、钾的配合施用，特别是重视钾肥的施用，以促进块茎膨大和物质积累。生长后期要控制氮肥施用量，防止藤蔓徒长。一般使用的钾肥有硫酸钾、磷酸二氢钾、生物钾肥等。在山药生长期内，一般需分次追施硫酸钾600kg/hm2，
才能达到较好的高产效果。生长后期结合防病治虫，根外喷施0.3%的磷酸二氢钾溶液2～3次，还可达到保叶防早衰的目的。
2.9病虫害防冶
2.9.1病害防治。病害主要有白锈病、褐斑病。白锈病于春季发生，褐斑病于夏季发生。防治方法：①搭支架，使通风良好，不能在阴湿积水的地方种植；②用波尔多液（1∶1∶140）或多菌灵800倍液喷雾防治。
2.9.2虫害防治。虫害主要有蛴螬、地老虎，咬食根部。防治方法：①结合整地施入辛硫磷或毒死蜱颗粒剂；②发生时用毒饵诱杀或药液灌根等。
2.10防止畸形山药的形成
在山药栽培过程中，因不良环境条件、栽培措施、管理方法等因素的影响，使山药在生长过程中改变了内部组织结构，从而产生各种奇形怪状的山药，如山药块茎上端分杈、下端分杈、蛇形、扁头形、脚掌形、葫芦形、麻脸形等，这些统称为畸形山药。防止措施：①严格按技术规程操作，谨慎施用种肥，防治地下害虫施用毒土、毒饵时不能盲目加大剂量；②人工挖山药沟时应在冬前进行，通过冬春雨雪侵蚀冰冻使土块充分风化粉碎，随风化解冻及时填沟，填沟时仔细剔除上壤中的石块、砖块、沙砾等硬物。不要将大土块填入沟内；③施用充分腐熟的有机肥，如人粪尿、堆肥、厩肥和优质土杂肥，要利用夏秋季节气温高、易发酵腐熟的有利时机提前进行沤制。提倡有机肥和部分化肥在种植完山药后施入山药行间，把腐熟的有机肥铺施于2行山药之间的畦面上，耧划翻土15cm深左右，使土、肥充分混合，然后将畦面的肥土覆于山药垄的两侧。
