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Abstract：Objective To establish the methods for culture and identification of rat muscle-derived stem cells in vitro.Methods
By two-step method， the rat muscle was digested with type I collagen and trypsin， and the isolated cell suspension was purified by different adhesion time . The proliferation ability of muscle-derived stem cells was analysed through studying growth curve， and the obtained cells were identified with cell immunofluroescence technique．Results Highly purified MDSCs were harvested and they showed desmin(+) by cell immunofluroescence technique．Conclusions
MDSCs can be cultured in vitro and can be identified by desmin stain and used to tissue engineering as “seed”cells.
Key words：rat ; muscle derived stem cells ; culture in vitro
近年研究发现，成体骨骼肌中不但存在单能的成肌干细胞－卫星细胞，而且还含有多能的“肌源性干细胞”（muscle derived stem cells，MDSCs）。肌源性干细胞起源于胚胎血管祖细胞，在适当的微环境中，可分化为血细胞、成骨细胞、神经细胞等不同胚层的组织细胞，MDSCs的表面标志已被初步认识，对其分化的研究，及其分离纯化的技术研究正在进一步深入 ［1-3］。本实验经过技术改良，通过体外原代培养获得高纯度MDSCs，为组织工程的临床应用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料 I型胶原酶(Sigma)， 0.25%胰蛋白酶(Hyclone)，胎牛血清(Gibco)，高糖DMEM培养基(Gibco)，D-Hank’ s(Gibco)，青霉素及链霉素(国产)。小鼠抗大鼠Desmin一抗、羊抗小鼠FITC（异硫氰酸荧光黄）(武汉博士德)。
1.2 原代MDSCs的取材、分离纯化 参照参考文献所报道的方法［4，5］ ，选用新生3～5 d的S－D乳鼠5只；浸入75%的医用酒精中，5 min×3次，处死并消毒；无菌条件下取前肢肱三头肌，后肢腓肠肌，尽可能剔除脂肪、肌腱等结缔组织：用PBS液漂洗2次，将肌组织移入一小平皿，用眼科剪剪成乳糜状；加入1%的Ⅰ型胶原酶3 mL，37 ℃消化30 min；加入0.25%的胰酶3 mL，37 ℃消化45 min；加入5倍体积的胎牛血清中止消化，反复吹打后滤过200目的筛网，收集滤液，1 000 r/ min离心7 min，室温静置5 min弃上层液，细胞团块用生长培养基(含20%胎牛血清的DMEM)重悬，移入培养瓶中，该培养瓶称为PP1。PP1于37 ℃ 、含5%CO2的细胞培养箱中静置过夜，随后将悬液转移到另一个胶原包被的培养瓶中培养，此为PP2。此后连续4 d每隔24 h将悬液离心、重悬后转移至新的培养瓶中，分别为PP3～PP6。PP1～PP5弃去不用，PP6用于进一步的鉴定实验，细胞在达到约70%汇合时必须传代。
1.3 MDSCs生长曲线的绘制 取PP6传至第2代细胞，0.25%胰蛋白酶消化，以3.0×104个／孔接种于24孔培养板。每日取3孔消化后，进行细胞记数，共7日根据记数结果绘制细胞生长曲线。
2008年2月，29(1)1.4 MDSCs的免疫荧光鉴定 取PP6中的MDSCs培养到第3代时，把细胞培养在6孔板中的盖玻片上，第5 d细胞生长达70%～80%汇合，用75%乙醇固定30 min，PBS洗5 min，2次；加入5%BSA封闭液，常温下静置1 h，封闭非特异性结合，不清洗。滴加小鼠抗大鼠Desmin一抗，37 ℃孵育2 h；PBS洗5 min，3次；滴加羊抗小鼠FITC，避光孵育30 min；PBS洗5 min，3次；50%缓冲甘油封片，荧光显微镜下观察，照相。
2 结
果
2.1 分离细胞的形态、生长特性 PP1、PP2（图1A）贴壁细胞相对较少，大部分是长梭形的成纤维样细胞，其余是宽大而呈星形或不规则的杂细胞，增殖较快，1周左右即可完全融合。PP3（图1B）开始即有少量的短梭形、圆形或多角形细胞贴壁，成纤维细胞较少。随着纯化的继续，圆形或短梭形细胞的数量明显增加，到PP6（图1C）时超过80%，这些细胞贴壁后绝大多数为梭形或纺锤形， 有两极， 体积小， 胞核折光性强。少数细胞呈多角形， 有突起。随培养时间延长，细胞增殖、迁移逐渐形成规律性的平行排列。极易融合，生长呈方向性，若不加以控制及时传代，细胞可迅速融合成细胞链或聚成团块生长，细胞增殖速度减慢， 细胞相互融合， 形成肌小管（图1D）。图1A PP1、PP2贴壁细胞相对较少，大部分是长梭形的成纤维样细胞和宽大而呈星形或不规则的杂细胞×200
图1B PP3有少量的短梭形、圆形或多角形细胞贴壁，成纤维细胞较少×200
图1C PP6圆形或短梭形细胞的数量明显增加，超过80% ×200
图1D 细胞增殖、迁移逐渐形成规律性的平行排列。极易融合，生长呈方向性，细胞增殖速度减慢，×200
图1E、F 细胞特异性desmin染色呈阳性，荧光显微镜可见细胞发出绿色荧光×400
2.2 生长曲线 第2日开始进入对数生长期，第5日后由于接触抑制，增殖速度减慢(图2)。图2 传代MDSCs的生长曲线
2.3 对PP6的细胞表型鉴定 肌源性干细胞本身具有特征性的外形， 其胞浆中含有结蛋白(desmin) 可通过细胞免疫荧光方法鉴定。本实验采用小鼠抗大鼠desmin一抗对肌源性干细胞进行鉴定，细胞质desmin染色阳性（图1E，1F），细胞胞质呈现绿色荧光。观察500个细胞，90%为desmin阳性。
3 讨
论
近年在骨骼肌中发现了一群被称为MDSCs的细胞群体。预期它们在组织工程应用领域特别是细胞移植和基因治疗方面前景广阔。国外已在进行大量MDSCs介导的相关的基因治疗和组织工程的动物实验［6-8］，并取得了较明显的效果。因此建立和完善MDSCs培养方法，获取高纯度的细胞具有重要实用价值。
骨骼肌细胞是由胚胎的生肌节和各处的间充质细胞分化而成，在肌膜和基膜之间有一种体积较小的扁平成立方形细胞，称为卫星细胞［9］，是保留在成年骨骼肌内具有增殖分化能力的单潜能成肌干细胞，这种组织特异性的干细胞在出生后骨骼肌的损伤、修复和维持中起重要作用。有证据表明新近发现的肌源性干细胞(MDSCs)是一群与卫星细胞完全不同的细胞群。可能是一群未向任何方向定型的原始干细胞。
lee等［7］31-37从骨骼肌细胞中发现了MDSCs，与卫星细胞相比，其具有更多的分化潜能，不仅能分化成骨骼肌纤维，促进肌组织再生，还能分化成成骨细胞，促进骨骼愈合［5］，被认为是卫星细胞的前体。贴壁前的MDSCs呈小而圆的球形，折光性强，刚贴壁仍为圆形，贴壁后的MDSCs呈纺锤形，延迟分瓶时会融合成成熟的多核肌管，这与成纤维细胞不同。preplate技术利用差速贴壁获取MDSCs，其原理是成纤维细胞、内皮细胞的贴壁能力强于卫星细胞，卫星细胞的贴附能力又强于MDSCs，4 d内即可完全贴壁而此时MDSCs仍处于悬浮状态［6］1085-1100，实验中发现，组织块中加入胶原酶后很快就变成了乳糜状，胰酶对组织具有很好的离散作用，再通过反复吹打可将细胞从基膜中分离出来，得到的细胞为成纤维细胞、白细胞、内皮细胞、卫星细胞及MDSCs的混合物，利用差速贴壁法4 d后处于悬浮状态的细胞移出培养即为纯化的MDSCs。MDSCs本身具有特征性外形，我们通过结蛋白desmin染色鉴定其肌源性，通过其多向分化的能力来鉴定其干细胞特性。实验中我们还发现，随着乳鼠出生天数的延长，所取得的MDSCs的数量和活力逐渐下降，但出生时间太短，活力太差，又不利于取材。新出生3～5 d的大鼠最适宜进行原代取材。
结蛋白（desmin）是中间丝蛋白的一种，是成肌分化的早期的标志，常作为肌源性的标志，虽然成纤维细胞与骨骼肌内血管平滑肌细胞也产生结蛋白，但此细胞中结蛋白含量低，与抗体产生弱阳性反应，且仅有15％的desmin阳性率［10］，而通过本方法获取的MDSCs中desmin阳性率高达90%，由此可进行初步鉴别。
MDSCs属于成体干细胞，具有取材方便、免疫原性低、移植后存活时间长等优点，在组织工程和基因治疗中具有广泛的应用前景。通过对常规技术的改良，本研究建立了一种稳定高效的新生大鼠MDSCs分离纯化技术，并成功对MDSCs进行了鉴定，为MDSCs在基因治疗和组织工程的临床应用打下了基础。
参考文献
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【中图分类号】R691【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2009)10-0125-01
压力性尿失禁(SUI)为女性的常见病和多发病，其发病率约为1 S%-6O%，多发生于老年人，因受经济、宗教、教育程度等因素的影响，其实际发生率比统计发病率更高。SVl的症状严重与否都不自接危及生命，但它给患者的日常上作、生活及社交活动造成一定程度的影响，甚至会严重影响患者的生活质量乃至家庭和睦。
1临床资料
注射疗法是将药物、化学制剂或自体组织等注入后尿道或膀肌颈内口粘膜下，使尿道腔变窄、拉长，延长功能性尿道的长度，提高尿道阻力，起到关闭尿道内口和后尿道的作用，从而达到有效控制排尿的口的。这一治疗方法对尿道内括约肌功能障碍、尿道内压降低同时尿道、膀肌无其他病变等压力性尿失禁患者有较好的效果。注射疗法主要优点在于.以在局部浸润麻醉下进行操作，大多数患者的手术均.IJ.以在门诊进行，适用于老年及不能耐一受大手术的患者。口前注射疗法的研究主要集中在选择不同的注射材料上，理想的注射材料应该在结构上完整，无毒、无免疫原性、无变应原性，近期内不会被分解，能长时间保持其支撑作用。口前使用的材料尚难达到上述要求，因此寻找一种取材方便、生物相容性好、安全无毒、疗效满意的注射材料十分必要。
方法：无菌技术下获取SD大鼠双侧腹股沟区脂肪垫，消化离心，长期培养的方法获取脂肪源性间充质干细胞。倒置相差显微镜观察细胞形态变化，对培养细胞进行免疫细胞化学染色，鉴定其表面分子标志。SD大鼠24只分为3组，实验组（6只），对照组一（3只），对照组二（3只）。分别获取自体ADSCs，实验组进行荧光标记。然后实验组将荧光标记的ADSCs自体移植至尿道周围，对照组移植未并取尿道组织进行HE染色组织学分析。
2结果
原代培养显示培养的脂肪源性间充质干细胞2d左右开始壁,10d-14d左右可达90%融合,基本上为梭形成纤维样细胞形态,免疫细胞化学示 CD29阳性，CD34阴性。神经切断术后10天，除模型组和对照组一各有1只大鼠死亡外，均进行尿流动力学检测，三组手术前后ALLP分别为：对照组一为27.1±5.1和29.1±3.2cmH2O，对照二为29.5±4.9和27.4±72.3,模型组为24.8±3.8和14.7±3.0。模型组手术后ALLP明显降低，且组织学检查亦证明模型组大鼠尿道周围括约肌明显萎缩。
3讨论
本实验将荧光金标记的脂肪源性干细胞自体移植至大鼠的近端尿道周围，行冰冻切片，组织化学染色，荧光显微镜下观察.见荧光标记的细胞呈金黄色:后取组抗体免疫移植部位有较多的Desmin阳性的细胞，棕黄色，部分出现一定的方向性，未见明显炎症细胞浸润，说明己有细胞在局部存活并生长，提示能成为压力性尿失禁注射治疗的一种理想的注射材料，为将来进行细胞移植治疗压力性尿失禁提供了实验依据。
结论：①大鼠脂肪组织中含有丰富的多能干细胞。利用消化离心，长期培养的方法可获取大量的干细胞。②移植后大鼠的ADSCs，可以在尿道周围成活并生长分化。
参考文献
[1]梁月有.诊断女性压力性尿失禁的相关检查[J].新医学.2006,37（10）:687-689.
[2]王萌.尿道周围注射治疗女性压力性尿失禁的研究进展[J].国际泌尿系统杂志,2006,26（6）：798-802.
1. 1 材料
1. 1. 1 主要仪器:CO2培养箱、净化工作台、倒置显微镜、倒置荧光显微镜、共聚焦荧光显微镜、流式细胞仪。
1. 1. 2 主要试剂:DMEM 高糖培养基( Dulbeccosmodified Eagles medium，DMEM)、人表皮生长因子(EGF)、0.25%含 EDTA 的胰蛋白酶(0. 25% trysin-EDTA)、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、抗生素(penicillin，streptomycin)、PBS 缓冲液购自于 Gibco公司。Oct-4、Sox-2、SSEA-4、nestin、vimentin、BDNF、NGF、CD90 购自与 Abcam 公司。CD29、CD44 购自于 eBioscience 公司、CD45、CD11b 购自于 BD 公司。
1. 1. 3 实验动物:SPF 级孕 18 ～ 18. 5 d 的 SD 大鼠，购自中国军科院实验动物中心，许可证号:[SCXK-(军)2014-0004]，实验动物使用批准号:ILAS-PL-2014-001。在无菌条件下进行实验操作分离羊膜组织。
1. 2 方法
1. 2. 1 羊膜细胞分离及培养:SD 孕鼠腹腔注射 1% 戊巴比妥钠(0. 01 mL /g)，麻醉后，无菌条件下开腹，机械性分离子宫层，剥离胎盘，分离羊膜组织置于含有500 U/mL 双抗的 PBS 溶液中冲洗。将羊膜组织放置在含有500 U/mL 双抗的 DMEM 基础培养基中，无菌眼科剪将其剪至1 mm3左右的小块。将组织悬液移至50 mL 离心管中，1 000 r/min 离心 5min，弃上清液。加入 0. 25% 含 EDTA 的胰蛋白酶10 mL，37℃ ，5% CO2条件下消化 20 ～30 min。用含有10%胎牛血清的完全培养基终止消化。200 目不锈钢滤网过滤单细胞悬液，接种至 25 cm2培养瓶，含10% FBS、10 g/LEGF 和 500 U/mL 双抗的DMEM 完全培养基培养，隔天细胞换液，2 ～ 3 d 后细胞长满培养瓶85% ～90%时，进行细胞传代。
1. 2. 2 流式细胞术检测:取培养 2 ～ 4 代细胞，用0. 25% 含 EDTA 的胰蛋白酶消化，含 10% FBS 的DMEM 完全培养基终止消化。细胞计数将其稀释成1 106个，每个流式管1 mL 细胞悬液。每流式管加2 mL PBS 使细胞混匀，2 000 r/min 离心5 min，弃上清液。重复加2 mL PBS 重悬细胞，2 000 r/min离心5 min，弃上清液。每管加 50 L PBS 重悬细胞，加 抗 体 CD29-PE-Cy7、CD44-PE、CD90-FITC、CD45-PE-CY7、CD11b-APC，避光室温孵育 30 min。每管加2 mL PBS 重悬细胞2000 r/min 离心5 min，弃上清液。各管加300 L PBS 重悬细胞上机检测。
1. 2. 3 免疫荧光细胞染色:取 2 ～ 4 代细胞，0. 25%含 EDTA 胰蛋白酶消化，含 10% FBS 的 DMEM 完全培养基终止消化。加入完全培养基重悬，至24 孔板中培养。待细胞增殖至 70% 作用时，PBS 冲洗，4% 多聚甲醛(预冷)固定 10 min。PBS 冲洗 2 次，每次5 mim。1% Tuiton-100 孵育10 min。PBS 冲洗2 次，每次 5 mim。山羊血清工作液每孔 100 L 室温下封闭30 min。吸去山羊血清工作液，抗体稀释液稀释抗体 Oct-4(1∶ 200)、Sox-2(1∶ 200)、SSEA-4(1∶200)、nestin(1∶100)、vimentin(1∶100)，每孔100L，4℃过夜孵育。PBS 冲洗 3 次，每次 5 min。避光条件下，PBS 稀释 FITC 标记的羊抗鼠二抗(1∶200)，37℃避光孵育 30 min。PBS 冲洗 3 次，每次5 min。DAPI 封片剂封片。共聚焦荧光显微镜观察。
1. 3 统计学方法实验结果采用 x珋 s 表示，使用 SPSS 15.0 统计软件进行统计处理，对其进行单因素方差分析和LSD 检验，P 0. 05 表示差异具有统计学意义。
2 结果
2. 1 分离细胞培养分离培养大鼠羊膜细胞，镜下，细胞呈变形虫样生长(图 1a)，生长速度快(图 1b)，需隔天换液传代。本实验中大鼠羊膜细胞可传至6 ～7 代。
2. 2 流式细胞术鉴定细胞表面抗原结果经流式细胞术鉴定大鼠羊膜细胞间充质细胞表面标记物 CD29、CD44 分别为97. 6%和95. 8%。细胞表面抗原CD90、CD45 几乎不表达，CD11b 有少量表达(图2 见文后彩插6)。
2. 3 细胞免疫荧光鉴定细胞表面标记物结果本实验通过细胞免疫荧光方法检测大鼠羊膜细胞表达干细胞标记物 Oct-4 和 Sox-2(如图 3)，神经干细胞标记物 nestin 和间充质干细胞标记物vimentin(如图 4)，( 图 3 ～ 4 见文后彩插 7) 并表达胚胎干细胞标记物 SSEA-4(如图 5)。可表达神经营养因子 BDNF 和NGF(如图6)(图5 ～6 见文后彩插8)。
3 讨论
Analysis of different protein expressions in different liver cell strains in vitro using SELDI
【Abstract】 AIM: To examine the differential expressions of proteins in hepatoma cell line (HepG2)，hepatoma cell line transfected by HBV （HepG2.2.15）compared with normal liver cell line(LO2) by using surfaceenhanced laser desorption/ionization timeofflight mass spectrometry (SELDITOFMS)， so as to establish a foundation for further studying on the mechanism of hepatoma at the protein level. METHODS: The 3 types of cells above mentioned were cultured as general and collected when they were in good conditions. After cell disruption， SELDITOFMS was employed to detect the differential expressions of proteomes of HepG2， HepG 2.2.15 and LO2. RESULTS: Ninetyone proteins were captured by WCX2 array. Compared with normal liver cell lines， in the segments from Mr 5000 to 15 000， proteins in the HepG2 and HepG2.2.15 showed apparent changes， in which 2 proteins expressions were increased in carcinoma cells， the other 5 decreased. Nine proteins in HepG2 were increased and 10 proteins in HepG 2.2.15 were increased. CONCLUSION: The SELDI ProteinChip technology can be a desired method in detecting the biological markers in the earlier period of hepatoma. This method is of convenience， high sensitivity， and good reproducibility. The biological tags of tissuespecific proteins we found have a potential applying value in the early diagnosis of hepatoma. These tags are also meaningful in screening and identifying signal proteins from serum and tissue specimen in different types of hepatoma. Certain foundation has been established in studying the etiopathogenesis of hepatoma at the level of proteins， as well as the searching of new therapeutic target sites.
【Keywords】 SELDITOFMS; protein array analysis; liver neoplasms; tumor cells， cultured; distinct protein
【摘要】 目的： 运用表面增强激光解吸/离子化/飞行时间质谱(SELDITOFMS) 技术，检测体外培养的肝癌细胞株（HepG2），转染乙肝病毒的肝癌细胞株（HepG2.2.15）与正常肝细胞株（LO2）蛋白质的差异表达，筛选肝细胞癌的标志蛋白，为进一步研究肝癌发病的蛋白质组学机制奠定基础. 方法： 常规培养上述3种细胞，细胞状态良好时收集细胞，裂解细胞后采用 SELDITOFMS技术用WCX2芯片检测HepG2， HepG2.2.15， LO2细胞内蛋白质组学的差异表达. 结果： WCX2芯片共捕获91个蛋白，在Mr 5000~15 000区段，与正常肝细胞株比较，有7个蛋白质在两种肝癌细胞中出现明显变化，其中2个蛋白在肝癌细胞中表达量增高，5个蛋白在肝癌细胞中表达量降低；另外两种肝癌细胞株也有其各自的标志蛋白，9个蛋白分子在HepG2表达量增高，10个蛋白分子在HepG2.2.15表达量增高. 结论： SELDI蛋白芯片技术检测可作为检测肝癌早期生物标记的方法，它简便，敏感性高，重复性好，本文发现的这些组织特异性蛋白生物标记对肝癌的早期诊断有潜在的应用价值，对我们从血清或组织标本中筛选和鉴定不同型别肝癌细胞之间的标志蛋白有重要意义，从而为从蛋白质水平研究肝癌的发病机制及新的治疗靶位的寻找奠定了一定的基础.
【关键词】 表面增强激光解吸/离子化/飞行时间质谱；蛋白质陈列分析；肝肿瘤；肿瘤细胞，培养的；差异蛋白
0引言
原发性肝癌(HCC)在我国是常见的恶性肿瘤之一，其死亡率在部分城市中占恶性肿瘤死因的第二位. 每年有11万人死于肝癌，占全世界肝癌死亡人数的45%. 肝癌早期没有明显体征，多数病人确诊时已属晚期，难以治愈，死亡率很高. 所以，对于肝癌的早期诊断，在无症状的人群中发现早期病例，对控制肝癌的病死率有现实的意义. 因此，研究并寻找有价值的预警肝癌的标志物，成为进一步提高肝癌临床治疗水平的关键. 任何疾病在出现病理变化之前，细胞内的蛋白质在成分和数量上都会有相应的改变，癌症的发生是一个多基因多阶段多因子的动力学过程，HCC也不例外，目前对肝癌发生机制的研究大都是在基因水平，但是mRNA的水平并不能真正代表所表达的蛋白质水平，因此，要求对生物功能的执行者蛋白质进行研究.
蛋白质组是指一个基因组、一个细胞或组织或一种生物体所表达的全部蛋白质［1］. 蛋白质组学（Proteomics）是蛋白质组概念的延伸，是在整体水平上研究细胞内蛋白质组成及其活动规律的学科. 蛋白质组学技术为研究肿瘤标志物与肿瘤进展转移研究提供良好的技术平台， 为研究开辟了新的手段和视角. SELDI蛋白质芯片技术是近年来新兴的一种蛋白质组学技术，它具有简单、快捷、灵敏等特点，可以检测分子量在Mr 500~500 000之间的蛋白或多肽，而且所需样本体积小（0.5~400 μL）［2-3］. 我们应用细胞裂解液裂解体外培养的3种细胞（LO2， HepG2， HepG2.2.15），进行了表面增强激光解吸/离子化/飞行时间质谱技术（SELDITOFMS）分析，初步建立了正常肝细胞、肝癌细胞与转染乙肝病毒的肝癌细胞的蛋白表达图谱［4］，发现了一系列（信噪比）差异表达的蛋白，为今后从血清或肝癌组织中筛选标志蛋白提供科学依据.
1材料与方法
1.1材料正常肝细胞株（LO2）购自中科院上海细胞库；肝癌细胞株（HepG2）及携带乙肝病毒的肝癌细胞株（HepG2.2.15）由第四军医大学吴力克主任医师赠送. HPLC水，乙晴，三氟乙酸，白芥子酸（SPA），TritonX100，尿素，4羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES），表面活性剂（CHAPS）均购自美国Sigma公司，蛋白质芯片时间质谱分析仪（PBSⅡC）及WCX2（弱阳离子交换芯片）购自美国Ciphergen Biosystems公司.
1.2方法
1.2.1细胞总蛋白质的提取LO2， HepG2细胞采用含100 mL/L胎牛血清的1640培养基培养，HepG2.2.15细胞另外加入终浓度200 g/L的G418，细胞长成单层后，用无菌细胞刮刀刮取细胞，PBS洗3次，加入裂解液（8 mol/L urea， 40 g/L CHAPS， 40 mmol/L TrisHCl， pH 7.4）200 μL， 4℃剧烈震荡30 min， 20 817 g离心30 min. 上清采用日本日立的 Gene Spec V蛋白核酸分析系统测定蛋白浓度，用裂解液调节至所有样品浓度为2 g/L，其余上清分装-86℃备用. 每种细胞收获3次，以排除组间差别. 每份样品至少在2个以上的同种芯片上检测，以排除不同芯片间的差异.
1.2.2WCX2蛋白芯片操作步骤将芯片装入蛋白工作平台，每孔加入200 μL结合/洗脱缓冲液（50 mmol/L NaAc， pH 4.0）预处理芯片，室温下200 r/min振荡5 min，弃缓冲液，重复上述操作1次. 每孔加入50 μL 1∶2稀释的样品，剧烈震荡，室温孵育1 h. 弃掉样品，每孔用200 μL结合/洗涤缓冲液洗涤2次，每次震荡5 min. 弃去孔中液体，每孔加入200 μL HPLC 水，立刻甩出. 从蛋白工作平台中取出芯片，空气中干燥，每孔加入0.5 μL EAM（SPA中加入75 μL乙氰和75 μL 10 mL/L三氟乙酸）重复1次. 干燥后用蛋白质芯片阅读机进行质谱分析.
1.2.3数据采集和结果分析用加有Allinone标准分子量蛋白的NP20芯片校正质谱仪，仪器参数设置如下： 激光强度220，检测敏感度10，优化分子质量范围为Mr 2000~10 000，最高分子量为Mr 50 000，采用Ciphergen ProteinChip 3.0版本的分析软件自动采集数据，然后用Biomarker Wizard 软件分析LO2， HepG2， HepG2.2.15细胞的蛋白质谱差异.
2结果
2.1重复性试验为了保证试验结果的可靠性，我们首先进行细胞计数为1010/L，样品蛋白浓度为2 g/L以减少细胞本身蛋白的差异；同时每种细胞收获3次，以排除组间差别；每份样品至少在同种芯片3个以上不同点进行检测，以排除不同芯片点之间的差异. 然后用SELDITOFMS对样品孔进行测定，经质谱分析后选择了8个蛋白峰，测变异系数，结果显示其M/Z及强度的CV分别为1%， 5%，分析结果表明试验重复性好，结果可靠.
2.2差异蛋白的比较
2.2.1LO2， HepG2， HepG2.2.15三者比较明显差异蛋白峰共7个，其中Mr 7945， 7979在肝癌细胞中表达增高， 5818， 8428， 10 106， 10 312， 11 084在肝癌细胞中表达降低（图1）.
2.2.2肝癌细胞和转染乙肝病毒的肝癌细胞蛋白质表达差异HepG2， HepG2.2.15细胞差异蛋白峰共19个， 9个蛋白峰在肝癌细胞中表达增高，10个蛋白峰在肝癌细胞中表达降低（图2）.
2.2.3差异蛋白质的初步鉴定将发现的差异蛋白峰在Swiss蛋白数据库中搜索（us.expasy.org/tools/tagident.html），发现Mr 11 084.0蛋白峰与钙结合蛋白S100 A10相符. 其他几种蛋白暂时寻找不到.
A： LO2细胞；B： HepG2.2.15细胞；C： HepG2细胞. 上部分为蛋白峰表达情况: 横坐标表示相对分子量，纵坐标表示蛋白质峰的强度；Mr 11 084.6， 10 106.4蛋白在LO2中表达最高，在HepG2中次之，在HepG2.2.15中最低. 下部分为蛋白质图谱的模拟凝胶图： Mr 11 084.6， 10 106.4两条带是LO2， HepG2.2.15和HepG2细胞的差异蛋白.
图13种细胞在Mr 10 000~11 500区段的蛋白质检测结果（略）
A: Chip 19C G2; B: Chip 19H 2.2.15. 横坐标表示相对分子量，纵坐标表示蛋白质峰的强度. Mr 10 106.4， 11 084.0， 11 658.4蛋白在HepG2中高表达，在HepG2.2.15中低表达.
图2HepG2， HepG2.2.15细胞在Mr 10 000~12 000区段的蛋白质检测结果（略）
3讨论
肿瘤早期就可在蛋白质水平出现细微但重要的组合改变［5］，近来研究表明，肿瘤性疾病从蛋白质组学的角度又可以被认为是一种蛋白质缺陷病，其发生过程中有多种蛋白会发生异常变化. 从组织增生产生原位癌到产生癌变的过程中，有不同的功能性蛋白的参与；转移也是多步骤复杂连续的过程， 与转移有关的特殊基因受到激活并有多种水解酶的参与. 总之， 肿瘤在发生发展转移的过程中， 在分子水平有不同的功能性蛋白参与， 并且功能性蛋白很可能在各个环节相互协调共同表达. 蛋白表达异常不仅包括蛋白表达量的增加或减少，还包括蛋白翻译后加工上的改变，从而导致肿瘤组织表达的蛋白质谱(protein profile) 的改变. 因此利用蛋白质组学方法检测蛋白质谱的变化可以更加准确地诊断肿瘤及了解肿瘤的发病机制.
临床上现有的HCC标志物众多，但尚无单一标志物能够诊断所有HCC. 这就需要探索一种新的技术以发现早期肿瘤标志物. SELDI蛋白质芯片技术可检测疾病进展中不同阶段血清中多肽量的变化，翻译后修饰的改变或某些多肽的聚糖结构变化，为HCC肿瘤标志物的进展提供了一个新的方法，它灵敏度高、特异性好、重复性强、操作简单且微量化［6］，可同时检测血清中的多种蛋白质已被应用于检测多种生物学样品.
体外培养的细胞株虽然不能完全反映体内细胞的生长状态和生物学活性，但它具有成分单一、均质性好、实验条件容易控制等优点. 尤其在做对比性研究时可避免由组织细胞成分复杂，细胞异质性高等缺点造成的结果不真实和不可靠［7］. 我们培养了LO2， HepG2和HepG2.2.15细胞，裂解细胞蛋白定量后SELDITOFMS分析蛋白表达的差异. WCX2芯片，用于分析正电荷蛋白，弱阳离子碳化合物构成活性位点，与样品中赖、精或组氨酸反应，它捕获的蛋白pI一般大于4. 我们在分子量Mr 3000~30 000范围内，共捕获91个蛋白峰. 其中肝癌细胞株与正常肝细胞株差异蛋白共7个，不同亚型肝癌细胞与正常肝细胞比较有共同的差异蛋白，说明在肝癌的发生或发展过程中涉及到一些共同的蛋白质改变；我们对不同类型的肝癌细胞株差异蛋白质进行分析，结果HepG2， HepG2.2.15细胞差异蛋白峰共19个，表明不同肝癌细胞株也具有特异的差异蛋白，这对我们从血清或组织标本中筛选和鉴定不同型别肝癌细胞之间的标志蛋白有重要意义.
这些组织特异性蛋白生物标记对我们从血清或组织标本中筛选或鉴定标志蛋白有重要意义，对肝癌的早期诊断有潜在的应用价值，更主要的是为研究肝细胞癌变机制提供了一个基础，而且这些蛋白有可能为肝癌治疗提供新的靶位，可以进行RNA干扰来阻断其高表达或通过基因导入来促进低表达蛋白的表达.
用Swiss蛋白数据库中检索分子量和pI值匹配的蛋白质发现Mr 11 084蛋白峰可能为钙结合蛋白S100 A10. S100蛋白家族是一个有21个成员的钙结合蛋白家族， S100蛋白通过对钙离子的调节及与靶蛋白的相互作用，在体内发挥多种生物学功能. 研究发现 S100家族与肿瘤的发生发展关系密切，它们参与细胞周期调控，在多种肿瘤中表达异常，并与肿瘤的浸润、转移有关. S100 A10在肿瘤发生中的作用还不确定，它可能与Annexin II（p36）组成复合物，抑制p36磷酸化，参与细胞周期调控［8］. 在肝癌的发生中S100 A10可能通过p36起作用，它在肝癌细胞 HEPG2中低表达，抑制p36磷酸化的作用降低，从而抑制细胞增殖的作用降低，可能引起细胞生长失控而致癌.
从理论上讲，肝癌在发生、发展过程中其细胞内的蛋白质变化可以反应到血清中，可从体外培养的肝癌细胞株中筛选出部分与癌病人血清相一致的标志蛋白，有些改变可能只存在于细胞内而不分泌或代谢到细胞外，这部分蛋白可能是与癌症的发病密切相关的功能蛋白和调节蛋白.
目前，我们正进一步研究HBV感染携带者与HCC患者及正常人血清蛋白质的差异表达，结合体外培养细胞株的研究通过对比分析进一步筛选差异蛋白，下一步我们将蛋白纯化后进行序列测定，应用串联质谱分析鉴定特定的蛋白，以期确认肝癌的标志蛋白和功能蛋白，为临床肝癌的诊断提供新的思路，以期使肝癌的血清学诊断成为可能.
参考文献
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信息技术是伴随计算机和网络技术的发展而发展的，如今信息技术已经进入了发展的全盛时期，信息技术的发展对人们的生活、学习及工作方式产生了广泛而深刻的影响。在此背景之下，政工干部的培养工作也不免受到信息技术发展的影响，如何准确地把握信息技术发展水平及趋势对于政工干部培养产生的影响，科学利用信息技术的强大功能来提高政工干部培养的质量，是所有企事业单位需要思考的问题，妇幼保健院也不例外。
一、信息技术发展对妇幼保健院政工干部培养的影响
1.信息技术发展对政工干部素质提出了更高的要求
信息技术的发展使得信息化素质成为政工干部的基本素质之一，妇幼保健院的政工干部也不例外。信息化素质是指主体所拥有的各种信息品质，包括信息智慧、信息道德、信息意识、信息觉悟、信息潜能和信息心理等内容。信息化素质能让政工干部跟上时展的潮流，掌握最新的信息技术，也能让政工干部认识到信息的重要性而自觉地利用信息提高工作质量，培养政工干部终身学习意识。妇幼保健院作为医疗体系的一部分，一些医疗技术和医疗设备更新速度很快，政工干部必须具备较高的信息化素质才能捕捉到这些信息。具体来说，信息技术的发展要求妇幼保健院的政工干部全面提高自身素质，学好信息知识、掌握信息技能的同时，还要学习政工理论知识、医疗专业知识及人文社科知识等，培养政工干部的领导管理能力、沟通交流能力等。
2.信息技术发展对政工干部素质培养提供了新的条件
信息技术的发展改变了传统的信息的载体形式，拓宽了信息传播的渠道，极大地缩短了信息传播所需要的时间，使个人获得信息的成本大大降低，为政工干部的培养创造了有利的条件。首先，政工干部学习、沟通渠道更广。妇幼保健院可以在政工干部的培养课程中使用各种计算机辅助教学方式，它使课程内容更加生动有趣，能更好地激发政工干部的学习兴趣；依靠网络教学的方式还可以让政工干部充分利用网上丰富的信息资源，相互交流学习；此外政工干部还可以合理安排自己的学习时间，选择自己的学习方式，培养方式更加个性化。其次，政工干部利用信息的方式发生了改变。过去妇幼保健院的政工干部获取信息主要靠阅读各种纸质材料，现在政工干部阅读的载体扩展到网络信息，从文字扩展到图像、声音、三维等；在表达方式上实现了从直接手写到键盘输入、扫描等，包括直接复制或者删减其他文件；在计算方式上也不再需要人工计算，利用计算机准确又迅速减轻了政工干部数据统计分析的负担。
3.信息技术发展对政工干部素质培养带来的问题
首先，信息鸿沟现象比较严重。在妇幼保健院的政工部门中，政工干部的能力有高有低，在掌握和使用现代信息技术方面也存在较大差异，这给政工干部的信息培养课程增加了不小的难度。其次，网络信息量过于庞大。信息技术的发展使得，各种信息都能在网络上迅速传播，过量的信息会使人们很难找到自己所需要的信息，造成信息利用效率的下降，其中一些有害的信息更是严重影响政工干部的培养工作。
二、提高妇幼保健院政工干部培养质量的对策
1.定期完善政工干部培养方案
信息技术的发展变化是日新月异的，妇幼保健院要保证政工干部的培养紧跟时代的步伐就必须根据时代的变化对培养方案和教学计划进行全面的调整和修订，但是不能改变的是要始终强调培养信息化素质的重要性。培养方案的完善和修改可以从以下几方面入手：教学目标、教学内容、教学课程专题、教师师资、教学材料和教学组织形式等，要突出强调信息化素质的地位。
2.精心设计培养的专题体系
妇幼保健院政工干部培养的基本平台就是课程专题，怎样设计合理的课程专题也成为政工干部培养工作的难题，可以明确的是必须要依据信息技术的发展对各类政工干部知识能力素质的客观要求来建立课程专题体系，同时也要根据不同教学对象的性质、层次和类型做出调整。要根据政工干部的培养目标确定专题的类别和课时比例，各类专题都有围绕解决新时期思想政治教育工作来设计，专题设置和内容都要做到内容精干、素材新颖、实在管用，不仅要包括信息化知识和技术的课程，还要有其他方面的课题。
3.打造政工干部培养的环境条件保障体系
妇幼保健院可以从以下几个方面来支持政工部门的信息化工作。首先，配置完备的教学设施设备，包括计算机及网络、多功能教室等。其次，建设多样的信息化教学信息资源子系统，例如数字化图书馆信息资源、课程网络信息资源、教学管理信息资源等。
总之，为了让信息技术的发展更好地为妇幼保健院的政工干部培养工作服务，需要站在全局的高度将信息技术理论和方法应用到培养的全过程中，需要对政工干部培养的形式、内容、方法进行深刻变革，以提高政工干部培养的效率，全面提高政工干部信息化素质培养的质量和效益。
参考文献：
[1]周军、夏婷婷，论信息技术发展对政工干部培养影响及其对策，中国信息界，2012（05）
目的 ：研究糖尿病是否会导致在体外培养条件下自体骨髓间充质干细胞的增殖、分泌和抗凋亡能力的改变。方法：利用链脲佐菌素（STZ）诱导制作成年大鼠糖尿病模型（n=6），正常大鼠作为对照组（n=6），分别于体外利用全骨髓贴壁法来扩增和纯化骨髓间充质干细胞后，取生长良好的第2代细胞作为本实验的研究对象。采用Cell Count kit-8（CCK-8）分别绘制两组细胞的生长曲线来评价增殖能力；采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血管内皮生长因子（VEGF）和胰岛素样生长因子-1（IGF-1）的分泌量；应用Hoechst33342染色和膜联蛋白V/PI双染流式细胞术观察细胞在低氧无血清条件下的抗凋亡能力。结果：来源于糖尿病大鼠的骨髓间充质干细胞的增殖较正常的大鼠显著性减慢（P
【关键词】 糖尿病 间充质干细胞 VEGF 细胞凋亡 增殖 大鼠
Abstract: Objective: To study the effect of diabetic inner environment on the biological properties of marrow mesenchymal stem cells derived from bone(BMSCs). Methods: BMSCs were harvested from the normal and diabetic rats induced by streptozotocin (STZ). Cell proliferation was evaluated using cell counting kit-8 (CCK-8) assay. The secretory volume of vascular endothelial growth factor (VEGF) and insulin-like growth factor (IGF-1) were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and the anti-apoptosis capacity of the cell under the hypoxia and serum deprivation (hypoxia/SD) was detected by Hoechst33342 staining and annexin V/PI dual-color flow cytometry. Results: BMSCs from the diabetic rats induced by STZ could be successfully harvested and expanded in vitro. However they showed more spread-out and flattened appearance and larger size. The proliferative ability of diabetic rats derived from BMSCs were significantly decreased compared with the normal rats (P
Key words: diabetes；mesenchymal stem cells；vascular endothelial growth factor；apoptosis；proliferation；rats
干细胞治疗心肌梗死已被证实是一种较有前景的治疗方法。骨髓间充质干细胞（bone mar-row mesenchymal stem cells，BMSCs）由于具有取材容易、体外增殖能力强、低免疫原性、可分化为不同类型的成熟细胞等优点[1-2]，成为最佳的移植细胞来源。但是和其他体细胞类似，BMSCs也易受各种因素如：年龄、氧化应激和高糖[3-4]等的影响而导致其生物学性状改变。
糖尿病患者复杂的体内环境，包括长期的高血糖、高血脂、酮体的增多、活性氧等，势必会对自身体内的BMSCs产生影响[5-6]。目前国内外在干细胞治疗心梗的研究中，大多采用正常或者年轻的BMSCs作为移植细胞来源。为了确定糖尿病体内环境对BMSCs的影响以及其能否作为自体移植的细胞来源，我们将以糖尿病大鼠来源的BMSCs作为研究对象，在体外培养条件下进行一系列的生物学特性检测，就此问题进行初步探讨。
1 材料和方法
1.1 动物
220 g Spraque Dawley(SD)大鼠由温州医学院实验动物中心提供，所有研究都经温州医学院实验动物委员会批准。
1.2 主要试剂
DMEM、胰蛋白酶、胎牛血清购自Gibco公司；链脲佐菌素（STZ）、Hoechst 33342购自Sigma公司；细胞低氧培养盒、缺氧催化剂购自BioM6rieux-sa(France)；膜联蛋白 (annexin)-V FITC细胞凋亡检测试剂盒购自北京宝赛生物公司；酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒购自R&D公司。
1.3 糖尿病大鼠模型的制备
12只健康的SD大鼠随机平均分为两组，分别为糖尿病组和正常对照组。两组大鼠在禁食12 h后分别予单次腹腔注射STZ柠檬酸缓冲液(55 mg/kg)和柠檬酸缓冲液。3 d后剪尾静脉测血糖，以>16.67 mmol/L视为糖尿病模型成功，腹腔注射后3周复测1次尾静脉血糖和体重，以确保血糖浓度>16.67 mmol/L。糖尿病模型合格的和正常对照组大鼠继续饲养10周，为下面实验做准备。
1.4 骨髓间充质干细胞的分离和培养
无菌条件下分别剥离糖尿病大鼠和正常对照大鼠的股骨和胫骨[3]，以全骨髓贴壁法分离并培养BMSCs，待状态良好的第二代细胞生长达到70%～80%汇合时可用于以下实验。
1.5 细胞增殖能力检测
取生长良好的第二代骨髓间充质干细胞，于96孔板的每个孔中加入100μL细胞悬液，细胞数为1.5×103，培养基每2天更换一次。于细胞接种后的7 d内，每天取5个孔进行检测，每个孔内加入CCK-8试剂10μL，置培养箱内孵育4 h后，用全自动酶标仪检测490 nm（参比波长630 nm）的吸光度值（OD值），取平均值，以培养时间为横坐标，以相应的OD值为纵坐标，描绘生长曲线。
1.6 间充质干细胞凋亡的检测
1.6.1 细胞模拟缺血处理(无血清和低氧联合处理)：当第二代细胞生长达到70%～80%汇合时用PBS冲洗2次，加入不含胎牛血清的DMEM培养基，然后迅速将细胞放入密闭低氧罐中，置于37 ℃、5% CO2 细胞培养箱内培养6 h。
1.6.2 形态学检测：将进行低氧和无血清处理后的细胞用PBS洗1次，然后加入含Hoechst33342的无血清DMEM培养基，Hoechst33342终浓度为0.1 mg/mL，室温避光反应10 min。用荧光显微镜观察，紫外光激发，观察凋亡细胞并摄片。
1.6.3 流式检测：取经低氧无血清处理的7×105个细胞，用0.125%胰蛋白酶/0.04% EDTA消化细胞后，4 ℃，以800 r/min离心4 min后，弃掉上清液；细胞用PBS冲洗1次后悬浮于200μL结合缓冲液。然后加入10μL 20μg/mL的异硫氰酸荧光素(FITC)标记的膜联蛋白V(膜联蛋白-V-FITC)，轻轻混匀后，4 ℃避光反应15 min。加入5μL 50μg/mL的PI，300μL结合缓冲液，轻轻混匀，用流式细胞仪检测活细胞、早期和中晚期凋亡细胞及坏死细胞所占的比例。
1.7 血管内皮生长因子（VEGF）和胰岛素生长因子-1（IGF-1）的ELISA检测
将生长良好的第二代骨髓间充质干细胞用PBS冲洗1次后，添加不含血清DMEM培养基置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱内培养6 h后，取上清液备用。按照ELISA试剂盒操作说明书，用双抗体夹心法分别检测细胞培养上清中VEGF和IGF-1的含量，每份标本设3个复孔。用全自动酶标仪测450 nm处吸光度值，取其平均值，根据所绘制的标准曲线计算出各个细胞因子的含量。
1.8 统计学处理方法
采用独立样本t检验。
2 结果
2.1 大鼠BMSCs的培养和增殖能力检测
采用常规细胞原代培养法，成功培养了糖尿病大鼠的BMSCs。相差显微镜下对细胞形态进行了观察，如图1A所示培养的原代细胞呈长梭型，集落生长，中间较密，夹杂着圆形高亮未贴壁的杂细胞，但是糖尿病大鼠的BMSCs所形成的集落较正常大鼠的明显要小，而且贴壁后4~5 d才表现出成纤维样生长特性。细胞传代后，在第1代和第2代细胞生长呈现明显的漩涡状，但是相对于正常大鼠BMSCs饱满的细胞形态，糖尿病大鼠的则表现为细胞伸展无力，且较为扁平。本实验所用细胞均为第2代BMSCs。利用CCK-8检测的结果显示(见图1B)，糖尿病来源的骨髓间充质干细胞增殖能力明显较正常来源的低（P
2.2 VEGF和IGF-1的分泌量
ELISA结果（见图2）显示糖尿病大鼠来源BMSCs的VEGF和IGF-1的分泌量较正常来源的明显降低(分别为P
2.3 细胞凋亡
在缺血无血清联合处理后(图3A)，相差显微镜照片可以显示明显的细胞凋亡表征，即胞核皱缩变圆，贴壁细胞数量明显地减少。Hoechst33342染色后，正常细胞核呈弥散均匀的荧光， 而凋亡的细胞， 细胞核与细胞质中可见浓染致密的颗粒荧光， 被认为是典型的凋亡细胞。
2.4 膜联蛋白V/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡膜联蛋白
糖尿病来源的BMSCs中早期凋亡细胞(膜联蛋白为V+/PI-）较正常大鼠来源的明显增多（P 0.05）。
3 讨论
随着冠心病发病机制研究的深入，更多的证据表明，作为代谢综合征之一的糖尿病和冠心病的发生有着密切的关系[5]。而糖尿病患者体内的高糖、酮体、氧化产物等有害物质的增多，势必对自体来源的BMSCs的性状产生影响。在本研究中我们通过利用STZ诱导糖尿病大鼠模型，在经体外培养后发现，糖尿病来源的BMSCs在增殖能力上明显减弱，并且在细胞的分泌和抗凋亡能力上也较正常大鼠来源的显著降低。
在BMSCs治疗心肌梗死的研究中，首先要在体外扩增得到移植所需的细胞量。我们在研究中发现，在原代培养中糖尿病来源细胞在贴壁后4～5 d才表现出成纤维样生长的特性，且糖尿病来源的BMSCs的增殖能力明显降低，并且细胞较为扁平。原代体外贴壁时间的延长和细胞形态的变化说明其对环境的适应能力降低，需要较长的时间来恢复其生长增殖能力。另外有研究表明，传代后细胞变为扁平，具有这样的形态特征为细胞衰老的表象[7]，并且与我们所得出的增殖能力的下降是相一致的。
另外在BMSCs移植提高梗死后的心功能上，干细胞所分泌的细胞因子被认为是提高心功能的主要因素之一[8]，其中VEGF和IGF-1在促进新生血管的生成和细胞增殖方面起着非常重要的作用。我们的研究表明，糖尿病来源的BMSCs其VEGF和IGF-1分泌量较正常来源的明显降低。Liu等[9]利用高糖培养多功能前体细胞后，VEGF的分泌量也可以得到类似的结果，但是其细胞来源为正常的幼年大鼠。在本实验中所采用的干细胞培养条件为正常的培养条件，说明糖尿病的体内环境对糖尿病来源的干细胞其分泌能力有不可逆的损害作用。另据研究表明，VEGF和IGF-1在糖尿病患者的肾脏和视网膜以及血液中的浓度明显高于正常水平[10]，但是糖尿病自身来源的BMSCs所分泌的VEGF和IGF-1较正常的明显降低，造成这种矛盾的结果，可能是不同的组织来源的细胞对于糖尿病内环境的反应性不同，并且VEGF和IGF-1在糖尿病肾病和视网膜病变等糖尿病并发症的发展中起着重要的作用。至于细胞移植后分泌的细胞因子，是否会加速糖尿病并发症的发展进程，需要更深入地研究。
影响干细胞治疗心梗疗效的另一重要因素是在干细胞移植后细胞在心梗区的存活率较低，而心肌梗死区缺血低氧的环境是导致细胞凋亡的主要原因。我们采用体外低氧无血清的方法建立细胞凋亡模型[11]，发现糖尿病组的抗凋亡能力明显较正常组下降。现有的体外研究表明，体外的高糖、丙酮醛类、活性氧产物（ROS）等环境对细胞的凋亡起着很大的促进作用，而这些因素在糖尿病患者中均存在。另外，VEGF的分泌减少和糖尿病BMSCs在体外培养条件下的所表现出细胞衰老的形态学特征，抗细胞凋亡能力的下降也起着重要的促进作用。
目前关于糖尿病大鼠来源的BMSCs在增殖、分泌和抗凋亡能力下降方面的确切机制目前尚不清楚，可能与糖尿病体内复杂的病理生理条件造成干细胞的线粒体功能障碍[12]、高糖所导致的细胞复制性衰老[3]和相应的信号通道阻断等有关[9]。在本实验中，我们选择均为同龄的大鼠作为实验对象，避免了因年龄不同而造成的误差；在细胞培养方面，均在体外正常的培养条件下进行，从而可以得出糖尿病对BMSCs的各种生物学性状的损害是客观存在的。
本研究也存在若干不足，如没有将培养得到的糖尿病BMSCs移植回动物心梗模型体内，检测其对心功能的改善情况。另外，在糖尿病来源的BMSCs在抗凋亡能力、增殖能力和分泌能力损伤的机制上，没有做进一步的探讨，这也是我们下一步实验的方向。
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与ESA均为高水平表达，而CD184表达则在12个细胞系之间有差异。在单个细胞培养中，形成完全克隆、部分克隆与旁克隆3种形态，12个细胞亚系均源于单个细胞形成的完全克隆，均可进行连续传代与扩增，而部分克隆与旁克隆则在后续培养中逐渐衰老与消亡。结论 Tca8113M1细胞系中可能存在癌干细胞，而单细胞培养可形成完全克隆并建立细胞亚系，是进行舌癌干细胞后续研究重要的细胞培养模式。
[关键词] 单细胞； 有限稀释法； 舌癌干细胞； 完全克隆
[中图分类号] Q 21 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.01.021 癌干细胞是癌组织中一小群具有干细胞特性的细胞，具有自我复制与更新的能力，而且增殖与分裂能力极强，少量细胞即可形成体外移植瘤[1]。近年
有关肿瘤发生、转移、耐药与复发等诸多难题均从癌干细胞的角度进行研究。这种研究的基础和前提是明确癌干细胞的标志或分离出癌干细胞，以提供研究的靶细胞。目前已发现多种永生性癌细胞系中存在有癌干细胞，Tca8113M1舌癌细胞系同样可能存在有癌干细胞，可以作为舌癌干细胞的研究对象。鉴于癌干细胞独特的自我复制与更新能力，本研究以Tca8113M1舌癌细胞系为研究对象，采用有限稀释法分离出单个舌癌细胞进行体外培养，利用癌干细胞的自我复制能力进行分裂增殖，形成预期的单细胞克隆，进一步形成细胞亚系，以此证明Tca8113M1
舌癌细胞系中存在癌干细胞的可能性，同时检测细胞亚系癌干细胞标志的表达情况，观察不同细胞亚系的生物学特性，并且动态观察单细胞培养中细胞克隆形成的规律，为从Tca8113M1细胞系中分离舌癌干细胞提供前期实验依据。
1 材料和方法
1.1 舌癌细胞系来源
人舌癌细胞系Tca8113由上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔颌面外科肿瘤生物实验室建系，四川大学华西口腔医院赠送。右江民族医学院肿瘤分子生物学实验室在此基础上建立了转移人舌癌细胞系Tca8113M1[2]。
1.2 主要试剂和仪器
胎牛血清（Hyclone公司，美国），RPMI1640培
养基（Gibco公司，美国）；PE标记抗人CD44抗体，异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）标记的抗人细胞外可溶性抗原（extracellular soluble anti-
gen，ESA）抗体，PE/cy5标记抗人CD184抗体，同
型对照抗体分别为大鼠IgG2bκ2、小鼠IgG1与小鼠IgG2aκ4。CO2培养箱（日本三洋公司），流式细胞仪（BD公司，美国），倒置显微镜（Olympus公司，日
本）。
1.3 体外单细胞培养、建系及细胞克隆生长的动态
观察
采用有限稀释法进行体外单细胞培养与建系。Tca8113M1细胞经复苏后，使用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基在37 ℃、5%CO2培养箱中培养。用0.25%胰蛋白酶消化细胞制备细胞悬液，转移至96孔板，采用有限稀释法保证每个孔有1个细胞，在倒置显微镜下观察其生长和增殖情况，待其生长成多个细胞克隆后，用0.25%胰蛋白酶消化转移至6孔板扩增培养后，在培养瓶中反复传代建立细胞亚系。此外，在此培养过程中动态观察单个细胞形成细胞克隆的形态与生长情况，观察时点分别为3 d和1、2、3周。
1.4 舌癌细胞亚系成瘤性检测
建立裸鼠皮下移植瘤模型。体外培养Tca8113、Tca8113M1、Tca8113M1舌癌细胞亚系细胞，选取形态良好的生长期细胞，在生长旺盛时接种。具体步骤如下：消化收集舌癌细胞，800 r・min-1离心3～
5 min，弃上清液，计数细胞总量，以含10%胎牛血清的DMEM培养液按每毫升1×107个细胞的密度稀释细胞；消毒裸鼠右腋窝的皮肤，将细胞接种于皮下，以皮下结节直径超过1.0 cm为成瘤标准。共接种裸鼠45只，具体分组如下：1）Tca8113M1舌癌细胞亚系组，共12个亚系，每组3只，共36只；2）Tca8113M1舌癌细胞组，6只，为母系细胞系对照组；3）Tca8113舌癌细胞组，3只，为来源细胞系对照组。
1.5 流式细胞术检测舌癌细胞亚系癌干细胞相关标
志CD44、CD184、ESA的表达情况
将舌癌细胞（密度为每毫升1×106个）消化以后，800 r・min-1离心5 min，弃上清液，加入D-hanks液重悬，尽量将细胞吹散，将细胞悬液分别移入试管中（每管体积为500 μL），设置对照管和样本管。在对照管中加入同型对照抗体（分别是大鼠IgG2bκ2、小鼠
IgG1与小鼠IgG2aκ4）各5 μL，在样本管中加入荧光抗体（PE标记抗人CD44、FITC标记抗人ESA、PE/cy5
标记抗人CD184）各5 μL，置于避光环境下室温孵育30 min，然后于流式细胞仪上检测CD44、CD184、ESA的表达情况。
2 结果
2.1 Tca8113M1细胞体外单细胞建系培养
Tca8113M1单细胞培养12 h后，细胞贴壁；24 h后部分细胞出现变大变薄、空泡样变等老化现象；3 d后，有7个孔的细胞出现增殖分裂现象；7～10 d后有12个孔的细胞开始增殖为单个或数个完全细胞克隆（克隆形成过程见图l）。
培养4～6周后，细胞基本达到稳定生长并增殖的状态，以癌细胞的克隆样生长为主，细胞呈铺路石状，可见巨核、多核细胞，核分裂象多见。待培养孔接近80%铺满时，将细胞转移至6孔板上扩增培养，1～2周后转移至培养瓶中继续传代培养，稳定传代30代后冻存。本研究以有限稀释法获取192个Tca8113M1舌癌单细胞，并在96孔板中进行体外传代建系培养，获取12个细胞亚系，比例为6.25%，分别命名为Tca8113-S1～Tca8113-S12。
2.2 Tca8113M1细胞体外单细胞培养形成细胞克隆
的动态观察
以3 d和1、2、3周为观察时点，发现单个细胞形成细胞克隆的形态主要有3种：完全克隆、部分克隆、旁克隆。Tca8113-S1～Tca8113-S12细胞亚系的细胞均源于单个细胞形成的完全克隆，均可以进行连续传代与细胞培养扩增，而其他单个细胞培养形成的部分克隆与旁克隆则在后续培养中逐渐衰老与消亡，未能连续传代进行细胞扩增。3种克隆在培养过程中的变化情况如下。1）完全克隆：细胞之间紧凑密集成型，增殖速度快，其中1～2周为典型的完全克隆状，3周时在细胞克隆中央出现细胞重叠生长现象（图2中A1～A4）；2）部分克隆：克隆形态界于旁克隆与完全克隆之间，细胞间较疏松，其中1～2周为典型的部分克隆状，但第3周细胞克隆疏松，形状消散，
有转变为旁克隆的趋势（图2中B1～B4）；3）旁克隆：
细胞间疏松不成型，第1周较典型，第2、3周后细胞老化（图2中C1～C4）。
2.3 Tca8113M1舌癌细胞亚系成瘤情况
将舌癌细胞亚系Tca8113-S1～Tca8113-S12接种于裸鼠皮下后，1周后可触及皮下结节，表面光滑、质硬、可活动；2周后可见皮下结节生长迅速；3～4周后皮下结节最大直径达1.0 cm以上。含对照组在内的45只裸鼠均接种成瘤，成瘤率为100%。
2.4 流式细胞术检测细胞亚系癌干细胞相关标志
CD44、CD184、ESA表达情况
流式细胞术检测结果见表1：除了Tca8113-S1、Tca8113-S6与Tca8113-S10的ESA阳性表达率分别为60.7%±3.6%、74.1%±1.5%与65.3%±2.8%外，其余细胞亚系ESA的阳性表达率均在80%以上；各亚系CD44阳性表达率均很高，除了Tca8113-S7为68.9%±2.4%外，其余亚系的阳性率均在90%以上；12个亚系的CD184表达存在差异，阳性率在14.8%±3.5%至74.4%±1.5%之间波动。
3 讨论
本研究利用有限稀释法等经典的细胞培养技术，以舌癌Tca8113M1细胞系为研究对象，随机选取192个舌癌细胞，在96孔板中进行单细胞培养，经过长期传代培养，共建立12个舌癌Tca8113细胞亚系，比例为6.25%，而且都具备很强的成瘤性。进一步检测12个Tca8113细胞亚系的癌干细胞相关标志，结果发现：CD44与ESA均为高水平表达，阳性表达率多在90%左右，而CD184的阳性表达率则各有不同。据此结果可以结合癌干细胞的生物学特性对本实验获得的细胞系进行分析。
本研究发现：舌癌Tca8113M1细胞系中有6.25%的单个细胞可以进行自我分裂、增殖，形成细胞亚系。还有研究[3]发现：Tca8113细胞连续经过两次单细胞培养实验，其中具备分裂增殖活性的细胞比例为5.09%～10.85%。这提示即使在永生化细胞系中，具备持续增殖能力的细胞占整个群体的比例都较少。根据目前的文献[4]报道，在癌细胞群或组织中，癌干
细胞比例为0.01%～5%；体外培养的永生化癌干细胞系中，癌干细胞的比例可能偏高一些。本研究采用经典的有限稀释法获取单个细胞，这种细胞表现出强大的增殖与分裂活力，而且还形成了成瘤性很强的细胞亚系。这些单个培养的细胞是否就是癌干细胞尚需进行单细胞水平的鉴定，但可以大胆推测的是，其中应该包含有癌干细胞。肿瘤干细胞的概念于20世纪60年代提出，并据此建立了肿瘤细胞克隆实验。本研究在单个细胞培养中也发现，单细胞的增殖方式是克隆样增殖，即形成一个细胞克隆后扩大生长，并且在周围形成小的细胞克隆，最后融合成片，但究其细胞来源就是一个癌细胞而已，所有后续的细胞克隆与癌细胞就是源于它，所以可以认为该细胞具有癌干细胞的潜质，可以考虑从癌细胞系中筛选癌干细胞。
在12个Tca8113细胞亚系中，为明确其癌干细胞相关标志的表达情况，为后续舌癌干细胞的筛选提供前期实验数据，本研究综合文献报道，选取了CD44、ESA与CD184等癌干细胞相关标志进行检测。CD44是乳腺癌、头颈部肿瘤、结肠癌等上皮组织的癌干细胞的相关标志，CD184是胰腺癌干细胞的相关标志；ESA则是上皮来源的癌干细胞标志，而且属于细胞黏附分子[5-6]。在本研究建立的12个细胞亚系中，
CD44与ESA均处于高水平表达，而CD184的表达则高低不一，其中亚系间均数差值最大者接近60%。从这3个指标的表达情况来分析，可以进行如下推测：1）CD44与ESA是不同细胞亚系共有的标志，提示这些细胞亚系可能具有共同的组织起源；2）CD184的差异性表达提示Tca8113细胞系中存在细胞异质性，但从其比例来看，大致有3个等级，即15%、30%、50%以上，提示其生物学特性可能有明显的差别，但可作为舌癌干细胞研究的候选细胞群体进行研究。
此外，在单个细胞培养基础上建立细胞亚系的过程中，笔者发现单个细胞形成细胞克隆的形态与细胞最后成系关系密切。在单个细胞形成完全克隆、部分克隆以及旁克隆等3种克隆形式中，只有完全克隆能够形成细胞亚系，而且这些细胞亚系表现出肿瘤的异质性与成瘤性，而部分克隆以及旁克隆则在传代与扩增培养过程中逐渐老化或消亡。这一结果可进行逆向推理：将最初形成完全克隆的12个细胞确定为舌癌干细胞，而其形成的完全克隆则是癌干细胞自我更新与增殖的结果，其中可能富含癌干细胞。这一观点也为前列腺癌、小鼠肉瘤、胰腺癌以及神经胶质瘤等相关研究[7-12]所证实。这些研究发现完全克隆细胞可以高表达癌干细胞标志；接种1 000个完全克隆前列腺癌细胞就可形成移植瘤；通过悬浮球培养的癌细胞球在消化后进行单细胞培养，可以形成高比例的完全克隆。有学者[13]进一步在头颈肿瘤细胞系中发现，CD133与CD44阳性表达的癌细胞多形成完全克隆，而CD133与CD44阴性的癌细胞则多趋向于形成部分克隆或旁克隆，从而认为CD133与CD44是头颈肿瘤癌干细胞的标志。由此可见，完全克隆为癌干细胞的自我更新方式与富集、纯化癌
干细胞及癌干细胞标志的研究提供了新的途径，近年在癌干细胞研究中逐渐被应用和关注[11]。此外，针对完全克隆的研究切入时间与方式也需要注意。在本研究中，典型的完全克隆在单个细胞培养1～2周时形成，最好不要超过3周；扩增培养后，可使癌干细胞比例减少或分化细胞比例增加，从而影响对癌干细胞行为学的观察。
本研究属于寻找舌癌干细胞的前期性和阶段性实验，但是结果很有意义，这12个细胞亚系表明了Tca8113M1细胞系中有存在舌癌干细胞的可能性，而其最初的来源细胞系Tca8113也应存在癌干细胞。结合细胞克隆形态分析的单个癌细胞培养模式可为深入研究舌癌干细胞提供细胞研究平台。
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1978年，罗伯特•爱德华教授和同事一起成功地使第一例试管婴儿诞生，从此开创了生殖医学领域的新纪元。试管婴儿在20多年前也曾被世界舆论界视为洪水猛兽而大加抨击，但时至今日，这项技术已经被全世界绝大多数国家承认，堪称医学史上的一大奇迹。迄今为止，全球已有上百万试管婴儿诞生。
被誉为“试管婴儿之父”的英国剑桥大学教授罗伯特•爱德华说：“克隆单纯从技术上讲非常简单，就是把卵细胞中DNA去掉，然后将体细胞中的DNA移入其中。这在世界上任何一个试管婴儿实验室中都可以完成，困难在于如何降低克隆的危险。”
本文以此热点问题作为命题材料，对2011年高考生物试题进行单项预测。预测材料及其涉及的知识、试题如下：
1．试管婴儿
【知识链接】要做好有关“试管婴儿”的试题，除了书本上的知识外，还要掌握“试管婴儿”技术的有关知识。“试管婴儿”技术是通过将不孕夫妇的和卵细胞取出在试管中完全受精，并在试管中培养使其发育到囊胚期，再将胚胎移入女性子宫内使其发育成胎儿。
体外受精步骤包括：的采集与培养、卵母细胞的获取与培养、体外受精等操作技术。具体过程如下图:
哺乳动物胚胎发育的过程大体概括如下图：
例1 下列关于关试管婴儿的说法，不正确的是（）
A. 从良种母牛体内采集的卵母细胞都需要进行体外培养
B. 从良种公牛采集的需进行获能处理
C. 早期胚胎移植的意义在于提高优良母畜的繁殖率
D. 早期胚胎指的是由受精卵发育至原肠胚时期的胚
解析：本题考查了试管婴儿的相关知识。根据体外受精和胚胎发育过程图解可知，早期胚胎指的是由受精卵发育至囊胚时的胚。
答案：D
例2 据2008年1月17日《干细胞》杂志报道，某科学家使用了进行试管受精的年轻女性捐献的卵子，以及2名志愿者的皮肤成纤维细胞，成功克隆出了5个人体胚胎，进而可以开发出有研究价值的干细胞。请回答：
（1）上述过程中主要应用到的两项动物细胞工程技术为；若将某经过修饰的基因导入其中的部分胚胎干细胞，常用的方法是。
（2）在使用合成培养基进行胚胎干细胞培养时，通常需要加入等天然成分；在细胞培养时，要保证被培养的细胞处于一定的气体环境，所需要的气体主要有 。
（3）科学家欲进行胚胎分割移植，则应该选择发育良好、形态正常的或囊胚，将其移入盛有操作液的培养皿中，然后用分割针进行分割。
答案：（1）动物细胞培养、细胞核移植显微注射技术（法）
（2）血清（血清、血浆） 氧气和二氧化碳 （3）桑葚胚
2．克隆人研究
【知识链接】克隆人的基本原理是动物细胞核的全能性，包括胚胎细胞核移植和体细胞核移植。其基本过程为：
细胞核移植技术中注入去核卵母细胞中的不是供体细胞核，而是整个细胞，伴随着两细胞融合，体现细胞膜的结构特点：具有一定的流动性。该技术形成重组细胞继而发育成一个新个体，体现了细胞核的全能性而非动物细胞的全能性。
例3 下图为克隆人的示意图，据图回答：
（1）图中所涉及的现代生物技术有、和
等。
（2）下列有关胚胎移植的叙述正确的有（）
A.冲卵指的是从子宫中冲出胚胎，而非冲出卵子
B.只有供、受体生理环境高度一致，移入受体的胚胎才能被接受，并继续发育
C.供体和受体要进行免疫检查，防止发生免疫排斥反应
D.不同动物其胚胎移植的时间不同，人的胚胎移植最好在四个细胞阶段进行
（3）图中两个婴儿长大后，外貌、性格和其他特征与原型男人相同，这说明 具有全能性。
（4）使用培养基进行胚胎干细胞培养时，通常要加入等天然成分，除了保证被培养细胞处于无菌、无毒及充足氧气的环境中，还需要保证细胞生活所需的；早期胚胎发育在阶段以前的细胞是全能细胞。
（5）图中从“内细胞团到胚胎干细胞”的培养过程中，必须用处理内细胞团，使之分散成单个细胞。干细胞形成组织、器官必须要进行 和 。
（6）在体外培养胚胎干细胞能否获得动物器官?
。为什么？
解析：（1）该图利用了细胞核移植、动物细胞培养、胚胎分割移植等技术。（2）冲卵一般是指是胚胎收集中的冲卵――胚胎、早期胚胎。供体和受体只有保证具有相同的生理状态，才能保证胚胎的正常发育。（3）克隆过程说明动物细胞核具有全能性。（4）动物细胞培养液的成分包括葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。动物细胞培养的条件：无菌、无毒的环境；营养物质（合成培养基）；温度和pH（36.5±0.5℃，7.2～7.4）；气体环境（氧气和二氧化碳）等。（5）动物细胞培养过程常用胰蛋白酶处理组织，以使之分散成单个细胞。（6）胚胎干细胞在体外培养条件下一般只能增殖进行细胞分裂，不能发生细胞分化。
答案：（1）核移植 胚胎移植 细胞培养（另外写细胞融合、胚胎分割也对，写了三个则给满分）（2）ABD（3）动物体细胞核 （4）血清 温度和pH 桑葚胚（5）胰蛋白酶 细胞的分裂 分化 （6）不能 胚胎干细胞在体外培养条件下可以增殖而不发生分化
3．生物技术中的伦理问题
【知识链接】生物技术引发的伦理问题包括克隆技术引发的伦理问题、试管婴儿引发的伦理问题、基因检测引发的伦理问题。中国政府对于克隆技术的态度是禁止生殖性克隆人，不反对治疗性克隆人；对于试管婴儿的态度，中国卫生部的规定是实施体外受精、胚胎移植及衍生技术必须获得卫生部的批准证书。
例4下图所示为人类“治疗性克隆”的大致过程。请回答下列问题：
（1）图中①为 细胞，过程A是目前实现体细胞克隆的关键技术，该技术称为 。
（2）图中③能诱导分化出神经细胞、血细胞、肌肉细胞，其根本原因是 的结果。这样培育得到的组织器官进行自体移植的最大好处是 。
（3）若应用转基因技术治疗遗传性糖尿病，可将健康人的控制胰岛素合成的基因导入结构④中的
，原因是这些细胞 。
（4）在用PCR技术扩增胰岛素基因时，缓冲溶液中必须加入的物质有：、分别与两条模板链结合的两种引物、 以及四种脱氧核苷酸。DNA的合成方向总是从子链的延伸。
（5）我国政府禁止生殖性克隆，但不反对治疗性克隆研究。为什么要反对生殖性克隆（即克隆人）呢？请你写出一条理由： 。
解析：从图可以看才出，治疗性克隆是将患者的体细胞的核与卵细胞的细胞质进行重组， 形成重组细胞，将重组细胞经过培养得到囊胚，取囊胚内细胞团培养得到不同组织器官，可用于进行自体移植，不会产生免疫排斥反应。
答案：（1）次级卵母（卵） 核移植
（2）基因选择性表达不会产生排异（免疫排斥）反应
关键词： β细胞素; 糖尿病 胰腺干细胞
胰岛移植是治疗糖尿病的一个热点, 但供体的缺乏和存在免疫排斥反应限制了其应用。胰腺干细胞能定向分化成胰岛细胞, 这为胰岛移植提供了新的材料来源［1］。细胞生长因子在干细胞的发育和分化中发挥了重要作用。研究表明, β细胞素（betacellulin, BTC）属于表皮细
胞生长因子家族中的一个成员, 具有多种生物学功能, 胰腺BTC mRNA的高水平表达, 提示BTC可能在胰腺组织的发育中发挥重要的生理作用［2, 3］。本研究中通过建立稳定的胰腺干细胞体外培养方法, 将β细胞素用于胰腺干细胞的体外培养, 观察其是否能促进胰腺干细胞转分化为成熟的胰岛, 为克服胰岛移植时的供体短缺提供新的胰岛来源。
1 材料和方法
1.1 材料
SD大鼠（体质量250 g, 雌雄不限, 饲养于清洁级动物房自由饮水和进食, 手术前1 d禁饮食）由第四军医大学动物中心提供, Ⅴ型胶原酶、 Histopaque(1.119 kg/L)、Histopaque(1.098)(kg/L)、 Histopaque(1.077 kg/L)、 碱性成纤维细胞生长因子2(basic fibroblast growth factor 2, bFGF2)、 角朊细胞生长因子(keratinocyte growth factor, KGF)、 ITS(insulintransferin selenium)购自Sigma公司; 牛血清白蛋白(BSA) 购自杭州四季青生物制品公司; 双硫腙（dithizone, DTZ）、 二甲基亚砜（DMSO）、 烟碱购
于华美公司; 兔抗小鼠的PDX1和CK19抗体购自北京中山生物工程有限公司; 免疫组化SP检测试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司; CMRL1066、 DMEM/F12 购于Gibco公司; 胰岛素放射免疫分析试剂盒购于北京北方生物技术研究所; 大鼠β细胞素由本研究室采用基因工程方法获得［4］。
1.2 方法
1.2.1 大鼠胰腺干细胞的分离、 培养
采用宋振顺等［5］的方法, 首先以Ⅴ型胶原酶消化成年SD大鼠胰腺组织, 然后采用非连续密度梯度离
心法纯化消化后的胰腺细胞, 去除胰岛细胞后, 收集外分泌部细胞进行培养。所获的细胞培养在含100 mL/L胎牛血清的CMRL1066培养液中, 其中添加100 U/mL青霉素、 100 g/L链霉素、 500 μg/L二性霉素B。第3天将培养液改为DMEM/F12, 其中加入ITS（5 mU/L胰岛素+5 mg/L转铁蛋白+5 mg/L硒）500 μg/L二性霉素B, 2 g/L牛血清白蛋白、 10 mmol /L烟碱, 0.01 ng/L KGF等。此后每2～3 d换液1次。于相差显微镜下观察细胞生长状况和克隆形成情况。
1.2.2 胰腺干细胞免疫组织化学染色
分别取培养3、 7、 14 d后的细胞爬片, 0.4 g/L多聚甲醛(PFA)固定后, PBS缓冲液冲洗玻片, 分别与兔抗小鼠PDX1、 CK19 抗体4℃反应过夜, 二抗及呈色反应参照SP试剂盒说明。二氨基联苯胺(DAB)显色, 显微镜观察, 自来水冲洗, 苏木精复染, 中性树胶封固。阴性对照用PBS代替一抗。
1.2.3 双硫腙染色与计数
双硫腙(DTZ)为螯合剂, 可与铅、 铜、 锌等螯合, 人和动物（豚鼠除外）的胰岛β细胞因含有锌, 双硫腙染色呈猩红色, 其他胰岛细胞不着色。配制及染色方法: 用二甲基亚砜（DMSO）配制: DTZ 10 mg溶于10 mL DMSO, 用Hanks（pH7.8）1∶100稀释, 0.22 μm滤膜过滤, DTZ与胰腺干细胞培养后转分化形成的克隆混合, 室温5～10 min后做镜检。按胰岛的直径>50 μm计数染色的胰岛样细胞团, <50 μm者不计。
1.2.4 胰岛素检测
胰腺干细胞转分化后形成的胰岛克隆对葡萄糖刺激有胰岛素分泌反应。显微镜下挑取100个胰岛样细胞团克隆, 培养于24孔培养板, 先用含低糖（5.5 mmol/L）的DMEM/F12培养液在37℃下孵育1 h后, 更换为含高糖（16.7 mmol/L）加烟碱（10 mmol/L）的DMEM/F12培养液在37℃下孵育2 h后, 取培养液上清, 采用放免法测定胰岛素含量。
1.2.5 实验分组
按照实验方法1.2.1中胰腺干细胞的培养方法培养大鼠胰腺干细胞, 并将其设为正常对照组, 各实验组中分别加入不同浓度的大鼠β细胞素, 依次为10、 20、 30、 40、 50 mg/L, 共设立5个实验组。
1.2.6 统计学处理
采用Student t检验方法, 应用SPSS10.0统计软件完成统计学分析。
2 结果
2.1 成人胰腺导管上皮细胞光镜下形态学变化
干细胞是指具有自我更新能力和增殖分化能力的一类细胞，目前学习者对动物干细胞的理论和应用知识掌握较多。由于植物细胞的全能型，长期以来很多学习者误认为植物中不存在干细胞，再加上教师对干细胞这部分内容的讲授不透彻，造成学习者对植物干细胞、动物干细胞及植物愈伤组织细胞的概念往往混淆不清，存在植物干细胞认知上的错误，因此很有必要对植物干细胞的相关知识进行总结。
1.植物干细胞
1.1植物干细胞的概念和特征。植物干细胞是位于植物分生组织中固有的未分化细胞，具有自我更新和再生能力。植物干细胞具有很强的自我更新能力，并且可以分化为特化的细胞类型，这些特化的细胞产生新的植物器官（根、茎、叶和花等）。这些细胞表型的变化是由影响植物功能的基因表达变化引起的，受到内源性和外源性的信号共同调节[1]。植物干细胞的特征包括：能够形成所有分化细胞的类型；具有自我更新的能力，维持干细胞的数量；位于分生组织。
1.2植物干细胞与动物干细胞的比较。在动物中，通常将干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞具有全能性，它可以分化形成所有的成体组织细胞，甚至发育成为完整的个体；成体干细胞（如造血干细胞、神经干细胞、间充质干细胞、皮肤干细胞等）大多为多能干细胞，它们具有多向分化的潜能，可以分化形成除自身组织细胞外的其他组织细胞，真正具有全能性的细胞是受精卵和其分裂产生的子细胞。与此相比，许多植物干细胞具有旺盛的再生能力，在干细胞的整个生活周期中能使植物生长并且产生新的器官（如植物茎端分生组织中的干细胞和根端分生组织中的干细胞）[2]。
1.3植物干细胞与植物愈伤组织细胞的比较。植物愈伤组织细胞是由成体细胞经过脱分化而形成的具有分化能力的细胞，虽然愈伤组织的分化能力与植物干细胞相似，但它们在来源、细胞分化和增值能力等方面是不同的。植物愈伤组织细胞来源于异质性的体细胞，它是体细胞对损伤的暂时响应，是一个临时获得刺激的细胞，尽管愈伤组织具有干细胞样属性，但愈伤组织不易维持稳定的细胞分裂[3]。而植物干细胞来源于植物分生组织的同质性细胞，它们在植物的整个生命周期可以产生并形成新的组织和器官。
2.植物干细胞的类别与调控
根据分生组织的种类，植物干细胞可分为茎尖分生组织中的干细胞和根尖分生组织中的干细胞。
2.1茎尖分生组织中的干细胞。茎尖分生组织包括中心区和中心区下方的带状区。中心区包括上部干细胞区和下部的组织中心（即干细胞区下部靠近带状区的小细胞群）。干细胞分裂时上部的干细胞分裂成两部分子细胞，一部分干细胞后裔留在中心区并保持多能性；另一部分细胞则离开茎尖分生组织的中心区，但保持较快的分裂速度，最终分化为叶或者花原基器官，为侧生器官的生长和分化提供保证[4]。目前已知的位于干细胞周围“组织中心”的WUS（WUSCHEL）是保持茎尖干细胞特征的必要信号分子，它参与对茎尖干细胞的稳态调控，使整个植物茎尖干细胞保持连续不断的自我更新和分化。
2.2根尖分生组织中的干细胞。静止中心位于根尖分生组织中心，干细胞则围绕在静止中心细胞周围。静止中心作为组织中心维持周围干细胞的稳定和功能，静止中心周围的干细胞分布于中柱鞘外侧，维管干细胞形成维管组织、皮层/内皮层干细胞，进而形成皮层、内皮层与根冠干细胞，然后形成根冠细胞。目前已知的WOX5（WUS-RELATED HOMEOBOX 5）作为最主要的干细胞决定因子，特异的表达于根端分生组织的静止中心，参与对根端干细胞的稳态调控，使整个植物的根尖干细胞保持连续不断的自我更新和分化[4]。
3.植物干细胞的应用
3.1生产天然产物，开发药品或者化妆品。传统的植物细胞培养存在细胞生长缓慢、生产成本高等问题，而植物干细胞培养具有遗传稳定、细胞生长率和生长模式稳定、凝集程度低等优点，可以用来大量生产有用的植物天然产物，并用于药品、功能性食品、化妆品中。如悬浮培养紫杉干细胞可以生产松香烷型三环二萜、美丽红豆杉素A和美丽红豆杉素B等产物，以达到抑制肿瘤血管的生成和抗癌作用，而且其产值远大于传统细胞培养的产值，具有很好的开发前景[5]。
3.2植物细胞系库的建立和利用。一般的植物细胞冻存后存活率低，恢复生长能力慢，因此限制其在植物细胞培养中的应用。植物干细胞系在低温储藏方面有很大的优势，不仅有高的存活率，而且在低温储藏前后遗传物质没有变异，是植物细胞系库建立的很好材料。细胞系库的建立不仅会使研究材料的供应得到满足，而且使植物细胞系的研究周期缩短，并在植物种子资源的保存和利用方面发挥重要作用[6]。除了以上应用外，利用植物干细胞还可以进行植物干细胞的分子调控机制和分子设计育种等方面的研究。
4.结语
植物干细胞是位于植物分生组织中固有的未分化细胞，它们具有自我更新和再生能力。根据目前学习者对植物干细胞认识不足的实际，本文对植物干细胞、动物干细胞及植物愈伤组织细胞的概念进行了辨析，并对植物干细胞的分类及应用进行了论述。学习者清楚植物干细胞、植物愈伤组织细胞和动物干细胞的概念后，在学习植物干细胞的理论和应用等方面时才能正确理解相关的知识点。
参考文献：
[1]于荣敏，周良彬.食品与药品[J].2012，14（01）：52-55.
[2]李宝钧.哺乳动物干细胞的研究进展[J].畜牧业，2008，234（10）：24-27.
[3]游云，蒋超，黄璐琦.试析植物干细胞与动物干细胞的异同[J].中国中药杂志.2014，39（2）：343-345.
【关键词】 骨髓间充质干细胞；肝干细胞；细胞移植
骨髓间充质干细胞(MSCs) 具有多向分化潜能，可以在体外诱导分化出肝干细胞，此种骨髓源性肝干细胞可以为肝组织移植工程提供新的细胞来源。近年来的研究主要集中于体外诱导MSCs为肝干细胞，此种细胞具备了肝细胞的形态，在体外能够表现出一定的肝细胞功能〔1〕，但对骨髓源性肝干细胞在体内的定居和定位能力情况尚不明确。本实验通过对大鼠MSCs进行体外培养，诱导、分化出肝干细胞，同时建立暴发性大鼠肝衰竭模型，探讨骨髓源性肝干细胞同种异体移植后在受体大鼠模型肝内定居情况。
1 材料与方法
1.1 材料
低糖DMEM培养基(Invitrogen)、Percoll(Pharmacia，比重1.077 g/L)(Gibco公司)、胎牛血清(杭州四季青)、胰蛋白酶2(Sigma)、肝细胞生长因子（HGF)(CYTOALAB公司)、细胞培养箱(Forma公司)；纯系SD大鼠、3周龄、体重100～120 g(供体大鼠)和成年纯系SD雌性大鼠、体重180～220 g(受体大鼠)，由吉林大学实验动物中心提供。
1.2 骨髓源性肝干细胞培养
1.2.1 MSCs分离、培养及定向肝干细胞的诱导分化
从供体SD大鼠股骨提取骨髓细胞。用比重1.073的Percoll分离液行MSCs分离，加含抗生素及10%小牛血清的IMDM培养和扩增，取第3代MSCs加入HGF(20 μg/L)诱导定向肝干细胞分化。
1.2.2 诱导后的骨髓源性肝干细胞鉴定
用ELASA法检测细胞培养液中的甲胎蛋白（AFP)、白蛋白（ALB)。用免疫组化法检测细胞中细胞角化蛋白（CK)18、CK19和波形蛋白（Vimentin)的表达。
1.3 肝损伤动物模型的制作和分组
受体雌性SD大鼠20只，随机分为正常大鼠组和肝损伤组。肝损伤组用质量浓度10%D氨基半乳糖溶液一次腹腔内注射，剂量1 200 mg/kg体重。
1.4 同种异体大鼠骨髓源性肝干细胞移植
正常组大鼠和肝损伤组大鼠，分别以戊巴比妥麻醉，仰卧位固定，常规消毒、备皮、铺无菌巾，上腹正中切口，长约1 cm，于肝中叶以BD胰岛素注射器注射肝干细胞悬液0.4 ml（107/ml )，观察无出血后缝合伤口。
1.5 受体体内移植骨髓源性肝干细胞鉴定
应用PCR技术检测性别决定因子基因片段(sex determining region of the Y，Sry)。干细胞移植后1，2，4 w后取受体肝脏移植原位(注射部位)、邻位(距注射部位0.5 cm)组织，应用PCR技术检测〔2〕性别决定因子基因片段(Sry)。引物按文献〔3〕设计，由上海Casarry生物有限公司合成序列，外引物对SRY1/ SRY2扩增片段大小为317 bp，内引物对SRY3/SRY4扩增片段大小为121 bp。
2 结 果
2.1 骨髓源性肝干细胞的培养结果 大鼠MSCs经原代培养，细胞传代，诱导分化，细胞异形性较诱导前增加，表现为圆形、椭圆形细胞数量较诱导前明显增加，而梭形细胞数量减少，诱导培养10 d左右，细胞形态表现为圆形、椭圆形细胞为主，梭形细胞已极少见。免疫组化染色，二氨基联苯胺（DAB)显色，在倒置显微镜下，可见细胞形状显圆形或卵圆形，胞浆内出现棕黄色颗粒。CK18、CK19、Vimentin呈阳性表达。细胞培养液中AFP、ALB含量诱导前分别为(0.021±0.008) ng/ml和(0.72±0.14) g/L；诱导后分别为(0.403±0.042) ng/ml，(6.1±0.32) g/L。诱导后的AFP、ALB含量明显高于诱导前（P＜0.05)。表明经诱导的MSCs分化为肝干细胞。见图1。
2.2 肝损伤模型病理结果
D氨基半乳糖注射后，大鼠肝脏肝索紊乱，肝细胞肿胀变性、灶性及大片坏死，伴出血及炎性细胞浸润。见图2。
2.3 性别决定因子基因片段检测结果
肝损伤组：检测1 w时阴性，2 w时原位肝组织Sry阳性表达，邻位未表达，而4 w时原位及邻位组织检测到Sry表达，原位表达较2 w时增强，邻位较弱。正常肝脏组：1及2 w均未检测到表达，4 w时检测到原位微弱表达。见图3。
3 讨 论
MSCs具有多向分化潜能，特别是具有向肝脏干细胞、肝细胞及血管内皮细胞分化的潜能〔4〕，因而有望成为肝组织移植工程新的种子细胞来源。由于MSCs是成体干细胞，取材方便，可以来自患者自身，无排斥反应，故具有重要的临床应用价值。本实验根据文献报道〔5〕，使用HGF，使MSCs分化为肝干细胞，对骨髓源性肝干细胞同种异体移植后在受体大鼠模型肝内定居情况进行初步研究。
目前研究表明移植肝干细胞可存活于受体许多部位包括肝、脾、腹腔、胰腺、肺、肠系膜、肾及肾脂肪囊、腹膜后等部位〔2，6～8〕。肝脏由于其独特的营养环境、生理及解剖结构环境无疑是最理想的场所，可经门静脉输入或肝实质植入，该组实验采用肝脏植入方法，取得较好效果，说明此方法是安全可行的。本实验采用同种异体移植，应该考虑免疫排斥反应，但文献报道，纯化的MSCs具有独特的免疫原性，进行同种异体移植不需要预先应用免疫抑制剂，无免疫排斥反应，是良好的基因治疗靶细胞。
目前鉴定受体体内被移植后的肝干细胞有许多方法，其中较为常用的是以雄性动物为肝干细胞供体〔1〕，雌性动物接受细胞移植后，分化增殖的细胞 Y 染色体阳性，证明雌性受体内存活的细胞来自雄性供体细胞，这就可以清楚地将植入的细胞与原有的细胞区分开来，进一步研究移植作用，本实验采用雄性供体细胞为雌性受体移植，检测移植部位细胞的Y染色体表达情况，进而检测移植细胞是否定植。
实验结果显示，移植后2 w肝衰竭大鼠移植原位检测到表达，4 w表达明显增强，而且临近部位出现表达；正常大鼠在移植后4 w移植原位出现微弱表达。实验证实，骨髓源性肝干细胞在正常大鼠肝脏及肝损伤大鼠肝脏内均能定居，但在肝损伤大鼠肝脏内定居能力明显增强。考虑可能为大鼠肝损伤后，刺激机体分泌出各种促进肝细胞再生的生长因子，为移植细胞提供定居所需的微环境。文献报道，在正常大鼠体内，HGF等因子的活性是被抑制的，只有在肝损伤时，启动肝再生程序，这些因子才能被激活，引起肝细胞有丝分裂。
本文通过实验证实了大鼠骨髓源性肝干细胞移植后可以定居于受体肝脏内，而且在肝损伤后有利于干细胞移植的定居，这为下一步研究定居于肝内的骨髓源性肝干细胞的功能奠定了基础。
参考文献
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2 高英堂，马梦兰，刘 敏.人类Sry基因用于产前诊断的初步研究〔J〕.中华妇产科杂志，1997；32（11)：6524.
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5 张刚庆，方驰华，池达智.肝细胞生长因子诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的实验研究〔J〕.中华外科杂志，2005；43（11)：71620.
