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2011-06-09收稿；2011-09-04接受
本文系宁夏自然科学基金（No. NZ1147）资助项目
* E-mail: gaozn@nxu.省略
1 引 言
延胡索酸泰妙菌素（Tiamulin fumarate, TF）是一种半发酵半合成双萜类新型动物专用抗生素（结构式见图1），它通过抑制微生物核糖体内感受性细菌蛋白的合成，达到抗菌作用[1]。关于延胡
图1 泰妙菌素的结构式
Fig．1 Structure of tiamulin
索酸泰妙菌素的研究已报道的有反相高效液相色谱法（RP-HPLC）[2]、高效液相色谱法（HPLC）[3]、液相色谱-质谱联用法（LC-MS）[4]、液相色谱-二极管阵列紫外光谱-串联质谱联用技术（LC-DAD-ESI-MS）[5]和电化学方法[6,7]。而在电化学方法中主要集中在碳糊电极[6]和修饰碳糊电极[7]上的电化学研究，但TF在乙炔黑-离子液体复合修饰玻碳电极上的电化学行为、电化学动力学及电化学分析方法研究工作尚未见报道。
乙炔黑具有良好的电子传导性、较大比表面积和较强吸附能力等特性[8]，故被用于化学修饰电极修饰剂[9]。室温离子液体（RTIL）是指室温及邻近室温下完全由阴、阳离子组成的液体物质[10]，具有电位窗口宽，生物相容性好和离子导电性高，能促进电子传递等特点[11]，因此引起了电化学工作者的极大兴趣。
本实验在前期工作[6,7,12～14]基础上，将1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐 （[BMIM]PF6） 与AB混合, 制备了乙炔黑-离子液体复合修饰玻碳电极（AB-ILs/GCE），研究了TF在AB-ILs/GCE上的电化学行为及电化学动力学性质，并建立了TF含量的电化学定量测定方法。2 实验部分
2.1 仪器与试剂
CHI660A电化学工作站（美国CHI仪器公司）；电化学测定采用三电极系统：以CHI104 GCE （美国CHI仪器公司）和AB-ILs/GCE为工作电极，饱和甘汞电极（SCE）为参比电极，CHI115铂丝为辅助电极。
图2 不同电极的电化学阻抗谱图
Fig．2 Electrochemical impedance spectrum of acetylene black-ion liquid modified glassy carbon electrode （AB-ILs/GCE） （a）, AB/GCE（b） and GCE（c） in a mixture of 1.0 mmol/L K3Fe（CN）6-1.0 mmol/L K4Fe（CN）6 solution. Supporting electrolyte: 0.10 mol/L KCl. The frequency range is 0.1～105Hz.
TF原料药（宁夏多维泰瑞制药有限公司，批号：201005041）；TF注射液（赣州百灵动物药业有限公司，批号：080402）；1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐（[BMIM]PF6，纯度99%， 上海成捷化学有限公司）；实验用水均为二次蒸馏水。
电化学测试前于电解池中通入高纯氮除氧5 min。本研究所涉及到的电位均为相对于SCE的电极电位，所有电化学测试均在室温下进行。
2.2 AB-ILs/GCE制备及电化学阻抗谱表征
GCE先用0.3
SymbolmA@ m α-Al2O3 抛光至镜面，用水冲洗干净。再分别在丙酮和水中超声清洗2 min， 以除去残留氧化铝粉，晾干备用。准确称取8 mg AB并用微量取样器移取15
SymbolmA@ L [BMIM]PF6，将二者在研钵中混合研磨约20 min，得到糊状物，取少许糊状物均匀涂敷在已处理好的电极表面， 制得AB-ILs/GCE。电化学阻抗谱可表征电极表面修饰过程中电阻变化信息[15]。以1.0 mmol/L Fe（CN）63
Symbolm@@ /4
Symbolm@@ 为电化学探针对GCE （图2c），AB/GCE（图2b）和AB-ILs/GCE（图2a）进行了电化学阻抗谱测试。由图2a可知，AB-ILs/GCE在高频区出现半圆弧（半圆弧直径代表电荷转移电阻），且其电荷转移电阻明显小于AB/GCE和GCE的电荷转移电阻，表明AB-ILs/GCE上有着较高导电性及较小的电荷转移电阻；而在低频区AB-ILs/GCE的直线斜率远大于AB/GCE和GCE的直线斜率，说明在AB-ILs/GCE上电活性物质从溶液扩散到电极表面的电阻减小，扩散速率加快[16]。
3 结果与讨论
3.1 TF伏安行为
在0.10 mol/L NaH2PO4-Na2HPO4 （PBS, pH 6.8），扫描速度50 mV/s及电位窗口0.0～1.2 V的条件下，采用CV研究了1.0
SymbolmA@ mol/L TF在GCE（图3c），AB/GCE（图3b） 图3 TF的循环伏安图
Fig．3 Cyclic voltammograms of 1.0×10
Symbolm@@ 6mol/L tiamulin fumarate （TF） at GCE （c）, AB/GCE（b） and AB-ILs/GCE （a） in 0.10 mol/L PBS. Scan rate: 50 mV/s及AB-ILs/GCE（图3a）上的伏安行为。如图3c所示，TF在GCE上于0.74 V 处出现一个不可逆氧化峰，氧化峰电流为2.847
SymbolmA@ A；TF在AB/GCE上亦于0.74 V处出现一个不可逆氧化峰，氧化峰电流为4.386
SymbolmA@ A。与GCE相比，TF在AB/GCE的氧化峰电位基本不变，氧化峰电流增大约1.8倍；比较曲线a和曲线b发现，TF在AB-ILs/GCE的氧化峰电位略有负移，氧化峰电流增大约3倍。此结果表明，TF电催化氧化反应是一个不可逆电极反应过程，且AB-ILs/GCE对TF电催化氧化具有良好的催化作用。这可能是由于乙炔黑具有较大的比表面积，为TF的电催化氧化提供了较多的反应位点，加速了TF电子交换速率[8]；另外，离子液体的高离子导电性也能够进一步促进电子传递[11]。两者的协同作用使AB-ILs/GCE对TF的电化学氧化具有更好的催化作用。在10～400 mV/s范围内，采用CV研究了扫描速度对TF在AB-ILs/GCE上伏安行为影响。实验表明，随扫描速度增加, TF在AB-ILs/GCE氧化峰电位Epa发生正移，峰电流Ipa增大，且峰电流Ipa与扫描速度平方根（v1/2）呈良好线性关系，拟合方程为Ipa（
SymbolmA@ A）＝
Symbolm@@ 1.378＋2.778v1/2，R＝0.9962。该结果表明，TF在AB-ILs/GCE上电化学氧化是受扩散步骤控制的电极反应过程。
3.2 实验条件的影响
在电位窗口0.0～1.2 V，50 mV/s扫描速度下，分别以0.10 mol/L的KCl，Na2SO4，NaClO4，Na2HPO4-NaH2PO4（PBS, pH 6.8），NaAc-HAc，B-R （Britton-Robinson） 等为支持电解质，对5.0×10
Symbolm@@ 5 mol/L TF进行CV测试。实验表明，在PBS中TF具有良好电化学行为，因此选用PBS为支持电解质。
在pH 2.0～9.5 范围内考察了介质pH对TF伏安行为的影响。实验表明，在pH 2.0～8.0范围内Epa随pH值增大而负移，其线性方程为Epa＝
Symbolm@@ 1124.60
Symbolm@@ 55.67（mV/pH），R＝0.9985。依据Ep（mV）＝E.0
Symbolm@@ （59m/n）/pH 得到m/n≈1；已知n＝2[7]，由此计算得到质子参与数m＝2，即TF在AB-ILs/GCE上电化学氧化过程是2个电子2个质子参与的不可逆电化学氧化过程；在pH 8.0～9.5范围内， Epa随pH值增加而基本不变。而在pH 2.0～6.0范围内， 氧化峰电流Ipa随pH值增加而降低； 在pH 6.0～9.5范围内， Ipa基本不变。
3.3 电化学动力学
3.3.1 电荷转移系数α 根据上述实验结果，以Epa对logv作图，得到GCE及AB-ILs/GCE上Epa-logv关系，其线性方程分别为Epa （mV）＝63.62 logv＋635.4 （R＝0.9986），Epa （mV）＝149.0 logv＋551.3，（R＝0.9987）。斜率分别为63.62和149.0 mV。
根据完全不可逆扩散控制过程方程式[17]：
Ep＝（blogv）/2＋C（1）
式中， C为常数， b为Tafel斜率，b＝2.3RTn（1
Symbolm@@ α）F。 由Epa-logv关系直线斜率可得b/2，即：b＝2
SymbolvB@ Ep
SymbolvB@ （logv） ， 已知n＝2[7]，因此计算得到α分别为0.77和0.90。
3.3.2 电极反应速率常数kf
平板电极上可逆电化学反应的电流响应遵循如下关系式[18]:
I（t）＝nFAkfC（1
Symbolm@@ 2Ht/π）（2）
H＝kfD1/2Ox＋kbD1/2Rd（3）
对于完全不可逆电极反应，kb＝0，H＝kf/D1/2Ox，采用CA可以测得电极反应速率常数kf。由实验测得TF在GCE及AB-ILs/GCE上的I（t）-t1/2关系曲线 图4 稳态电流-时间曲线
Fig．4 Time-dependent steady state currents obtained at AB-ILs/GCE while increasing TF concentration at 0.80 V with a stirring rate of 100 r/min截距分别为5.85×10
Symbolm@@ 4 及 3.21×10
Symbolm@@ 4，计算得到TF在GCE及AB-ILs/GCE上的电极反应速率常数kf分别为8.87×10
Symbolm@@ 2和1.23×10
Symbolm@@ 1s
Symbolm@@ 1。
在相同实验条件下，利用稳态电流-时间响应曲线方法测定了TF在AB-ILs/GCE上的响应电流与浓度关系（图4），TF电流响应信号随其浓度成比例增长，响应时间小于5 s。最低响应浓度为0.2
SymbolmA@ mol/L。本方法检出限低，灵敏度高，可作为TF电化学定量测定方法。
3.4 电分析方法的应用
3.4.1 TF方波伏安行为 在电位窗口0.0～1.2 V及优化了的方波实验条件 （优化方波实验条件：振
图5 TF方波伏安图
Fig．5 Square wave voltammogram （SWV） of 1.0
SymbolmA@ mol/L TF at the at GCE （c）, AB/GCE （b） and AB-ILs/GCE （a） in 0.10 mol/L PBS
幅45 mV，方波频率5 Hz，电势增量6 mV） 下对1.0
SymbolmA@ mol/L TF进行SWV测试，得到TF 在GCE，AB/GCE及AB-ILs/GCE上的SWV曲线（图5）。TF在GCE上于0.70 V处出现一个不可逆氧化峰（图5c），TF在AB/GCE上亦于0.70 V处出现一个不可逆氧化峰（图5b）。与GCE相比，TF在AB/GCE氧化峰电位不变，氧化峰电流增大约2倍。比较图5a与图5b发现， TF在AB-ILs/GCE上氧化峰电位与AB/GCE上氧化峰电位相比略有负移，氧化峰电流增大2.1倍。此实验结果与循环伏安法所得结果基本一致，进一步表明AB-ILs/GCE对TF电化学氧化具有良好的催化作用。
3.4.2 电极重现性和稳定性 同一支AB-ILs/GCE电极于5.0×10
Symbolm@@ 5 mol/L TF溶液CV扫描10次，其氧化峰电流RSD为1.9%；平行修饰6次RSD为2.9%，表明制作的修饰电极有良好的重现性。电极在室温下放置48 h对， TF响应电流的变化量在±5%以内，表明该电极具有较好稳定性，电极寿命为30 d。
3.4.3 干扰实验 在相同实验条件下，TF浓度为5.0×10
Symbolm@@ 5 mol/L， 考察了常见离子和葡萄糖、蔗糖对TF催化氧化峰电流影响。实验结果表明，1000倍无机离子K.＋，Na.＋，SO2
Symbolm@@ 4，Cl.
Symbolm@@ ，NO.
Symbolm@@ 3和50倍酒石酸、柠檬酸、葡萄糖、蔗糖对TF电流响应信号无干扰。
3.4.4 线性范围及检出限 在相同实验条件下用SWV研究了TF氧化峰电流Ipa随其浓度变化关系。实验结果表明，TF氧化峰电流Ipa与其浓度在0.8～20
SymbolmA@ mol/L范围内呈良好线性关系，线性方程为Ipa（
SymbolmA@ A）＝0.74＋0.23C（
SymbolmA@ mol/L）， R＝0.9973；检出限（S/N＝3）为7.6×10
Symbolm@@ 8 mol/L。
3.4.5 实际样品测定 取市售延胡索酸泰妙菌素注射液5支，混匀，取适量该溶液置于100 mL容量瓶，用水定容。运用SWV方法对此溶液进行测定，加入已知量TF标准品进行回收率测定，测定结果见表1。
表1 TF注射液中TF含量及回收率测定结果（n＝6）
Table 1 Determination results of TF in injection samples（n＝6）
样品
Samples标示量
Labeled测得值
Found（mg）RSD（%）加入量Added（mg）测得值Found（mg）回收率Recovery（%）
1230.125 mg/支（ampoule）0.1252.20.0630.189101.8
0.1271.10.0750.20198.6
0.1272.90.0880.21599.7
由表1可知，所测得TF样品的相对标准偏差在1.1%～2.9%，加标回收率在98.6%～101.8%之间，表明本方法精密度和准确度符合定量测定要求。 结果表明，TF电催化氧化是受扩散步骤控制的电极反应过程，且AB-ILs/GCE对TF的电催化氧化具有良好的电催化作用。同时测定了电极过程动力学参数，据此建立了TF电化学定量测定方法。
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Electrochemical Behaviors and Electrochemical Determination of
Tiamulin Fumarate at Acetylene Black-Ionic Liquid
Modified Glassy Carbon Electrode
CHEN Ji-Wen.1, DUAN Cheng-Qian1,2, GAO Zuo-Ning1,CHEN De-Gang.3
.1（Key Lab of Energy Source and Chemical Engineering, College of Chemistry and Chemical Engineering,
Ningxia University, Yinchuan 750021， China）
.2（Higher Vocational College, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004， China）
.3（Duowei Tairui Pharmacy Limited Company, Yinchuan 750004， China）
Effect of Aminopeptidase Inhibitor on Differentiation Induction Activity of All-trans Retinoic Acid in Human Acute Promyelocytic Leukemia NB4 Cells and Its Mechanism
Abstract
This study was purposed to investigate whether aminopeptidase inhibitor，bestatin，can potentiate all-trans retinoic acid (ATRA)-inducing differentiation in NB4 cells，and to explore its mechanism. The NB4 cells were exposed to either bestatin and ATRA alone or in combination，the morphological changes of NB4 cells were observed by optical microscopy，the CD11b expression was measured by flow cytometry，the function of defferentiation cells was analyzed by nitroblue-tetrazolium (NBT) reduction assay，the mRNA expressions of c-myc and c-EBPε in NB4 cells were detected by RT-PCR，the c-Myc protein expression was determined by Western blot. The results showed that treatment with bestatin alone induced no significant changes in morphology，NBT reduction activity and CD11b expression in NB4 cells. NB4 cells incubated with 10 nmol/L ATRA plus 100 μg/ml bestatin showed more morphologic feature of metamyelocyte and band neutrophil than ATRA alone treated cells. 100 μg/ml bestatin enhanced the NBT reduction activity in NB4 cells induced by various concentrations of ATRA (10，20，40 nmol/L). The effects of various concentrations of ATRA in combination with 100μg/ml bestatin were statistically different from the effect of ATRA alone (P
Key words bestatin; ATRA; cell line，NB4; differentiation
氨肽酶抑制剂乌苯美司（bestatin）能抑制氨肽酶N/CD13和亮氨酸氨基肽酶活性，通过增强宿主免疫功能及诱导肿瘤细胞凋亡等发挥抗肿瘤作用［1，2］。有研究提示，bestatin能够诱导U937细胞的分化［1］，国内未见报道。我们以NB4细胞为研究对象，通过形态、功能和表面分化抗原等多层次实验研究，了解bestatin是否能诱导NB4细胞分化及（或）对ATRA的诱导分化作用的增强效应，并初步探讨其可能的机理。
材料和方法
主要试剂
Bestatin、ATRA均购于Sigma公司。bestatin以无菌去离子水溶解为1 mg/ml，分装之后-20℃保存；ATRA以无水乙醇溶解成10-5 mol/L的储存液，4℃避光保存，使用时用RPMI 1640细胞培养液将其稀释为相应工作浓度。NBT为BBI公司产品，以PBS配成0.1%溶液，过滤除菌后4℃避光保存，使用前1周内配制。RPMI 1640为Gibco公司产品。胎牛血清为JRH公司产品。CD11b-FITC标记单克隆抗体为Teotech公司产品。CD13-PE标记单克隆抗体为Becton Dickinson公司产品。TRIzoL试剂为Gibco公司产品，M-MLV逆转录酶和Taq DNA合成酶为Promega公司产品。鼠抗人c-Myc单克隆抗体（c-33）及羊抗人β-Actin多克隆抗体（I-19）均为Santa Cruz公司产品，使用时以TBST液分别按1∶500和1∶1 000稀释。ECL显色液为Santa Cruz公司产品。
细胞培养及药物处理
人APL细胞株NB4细胞（浙江大学肿瘤研究所惠赠）及人髓细胞白血病细胞株HL-60细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640细胞培养液中，置37℃、5% CO2培养箱中培养，2-3天传代1次。实验时取对数生长期的细胞，调整细胞密度为7×104/ml，以不同浓度ATRA和bestatin单独或联合处理，于不同时间收集细胞进行实验。
细胞形态学观察
取空白对照组及药物处理各组细胞悬液，离心，制备涂片，瑞氏-姬姆萨染色，用光学显微镜（Leica，40×10）观察细胞形态。
四氮唑蓝（nitroblue-tetrazolium，NBT）还原实验
按文献［3］报道的方法进行。空白对照组及药物处理各组细胞与NBT共孵育后，制备涂片，瑞氏-姬姆萨染色，光学显微镜下（100×10）观察，胞浆内含有蓝黑色颗粒者为阳性细胞，随机计数200个细胞，计算阳性细胞百分率。
细胞表面分化抗原CD11b和CD13的检测
取对数生长期HL-60细胞和NB4细胞或药物处理后各组NB4细胞离心，用PBS（pH 7.4）洗涤，调整细胞数为2×105/50 μl，加CD13-PE标记单克隆抗体8 μl或CD11b-FITC标记单克隆抗体5 μl，避光孵育30分钟，用PBS洗涤，上流式细胞仪检测。以Cellquest 1.2软件进行分析。
细胞总RNA提取和RT-PCR反应
总RNA提取 用TRIzoL一步法抽提细胞总RNA，按试剂说明书操作。甲醛变性凝胶电泳证实为完整RNA，紫外分光光度仪定量，A260 nm/280 nm比值均在1.8-2.0之间。
逆转录反应
样品总RNA 4 μg及随机引物0.5 μg，70℃ 5分钟，立即冰浴，离心。依次加5×逆转录酶缓冲液5 μl、10 mmol/L dNTP 1.25 μl、M-MLV 200 U，RNase抑制剂0.6 μl，DEPC水补至反应体积为25 μl，于27℃10分钟，37℃ 60分钟，72℃ 10分钟灭活逆转录酶，冰浴1分钟，结束反应。
PCR反应
PCR引物为上海Sangon公司合成。引物序列、反应条件及产物大小见表1。反应体系包括逆转录产物2 μl、10×PCR缓冲液2.5 μl、25 mmol/L MgCl2 1.5 μl、10 mmol/L dNTP 0.5 μl、25 μmol/L(c-myc与c-EBPε)或2.5 μmol/L(β-actin)上游及下游引物各0.5 μl、Taq DNA聚合酶1U，用灭菌去离子水补至终体积为25 μl。预实验确定产物与循环之间呈线性关系范围。取5 μl反应产物在15 g/L琼脂糖凝胶（含0.5 μg/ml溴化乙锭）电泳，电场强度5 V/cm，紫外灯下观察电泳结果，用凝胶成像系统（BIO-RAD公司）扫描分析条带灰度，以目的基因与β-actin的灰度比做半定量分析。Table 1. Sequences of primers，condition of PCR and sizes of PCR products（略）
Western blot
收集药物处理各组细胞（细胞数为2×106/ml），预冷的PBS漂洗2次，重悬于100 μl Lammiulis上样缓冲液（0.125 mmol/L Tris-HCl，pH 6.8，4%SDS，5%甘油）中，超声波裂解，于4℃离心13 000×g）15分钟，收集上清，蛋白样品保存于-80℃。按蛋白定量试剂盒（Bio-Rad公司）操作说明书进行蛋白定量，在10%聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜，转移后的硝酸纤维素膜以5%脱脂奶粉封闭1小时，分别与抗人c-Myc和抗人β-actin抗体及辣根过氧化酶标记的二抗孵育。ECL显色，显影于胶片。图像分析处理系统（Image Station 2000R）扫描，测定条带的面积和灰度，以二者之乘积进行半定量比较分析。
统计学分析处理
各项实验重复3次以上，以X±D表示，多组间比较F检验后采用方差分析及Tukey检验。相关分析采用Pearson相关。应用SPSS 10.0统计软件进行统计分析。
结果
NB4细胞表面有CD13的表达
NB4细胞CD13阳性表达率为94.79%（平均荧光强度为1739.59），对照组HL-60细胞CD13阳性表达率为95.49%（平均荧光强度为3107.49）。两者的CD13平均荧光强度有一定的差异，但阳性百分率差异不明显。
Bestatin与ATRA联合处理后NB4细胞形态改变明显
100 μg/ml bestatin单独作用72小时后，NB4细胞形态无明显改变。10 nmol/L ATRA单独作用72小时后，NB4细胞呈现部分分化的形态，细胞核/浆比例减小，核变小有凹陷。100 μg/ml bestatin与10 nmol/L ATRA联合处理72小时后，NB4细胞形态分化更加明显，细胞浆内空泡增多，核凹陷、扭曲更加明显，形态似晚幼粒及杆状核粒细胞的细胞增多（图1）。
Bestatin与ATRA联合应用后NB4细胞NBT还原能力明显增加
以一定浓度（50、75和100 μg/ml）bestatin单独处理72小时后，NB4细胞的NBT还原能力无明显改变（与空白对照组相比较，P>0.05）；不同浓度（10、20和40 nmol/L）ATRA作用72小时后，NB4细胞的NBT还原能力呈浓度依赖性增加，与空白对照组相比，差异明显。100 μg/ml bestatin与不同浓度ATRA联合处理72小时后，NB4细胞的NBT阳性率明显地提高，与单用相应浓度ATRA组相比，差异显著（表2）。Table 2. Effect of bestatin on the NBT reduction activity of NB4 cells induced by ATRA. (略)
100 μg/ml bestatin单独处理细胞不同时间（48小时-96小时），NB4细胞的NBT还原能力改变不明显（与相应时间点空白对照组相比，P>0.05）；10 nmol/L ATRA处理细胞至72小时，开始出现NB4细胞NBT还原能力的增强，并呈时间依赖性，与相应时间点对照组相比，有明显差异；而10 nmol/L ATRA与100 μg/ml bestatin联合处理48小时，就出现NB4细胞NBT还原能力的明显增强，且此作用随时间延长而明显增强，与相应时间点单用10 nmol/L ATRA组相比，差异显著（图2）。
Bestatin与ATRA联合处理后NB4细胞CD11b表达明显增强
100 μg/ml bestatin单独处理72小时后，NB4细胞CD11b阳性表达率（MFI为13.4±0.6）稍有增加，但与对照组（MFI为12.3±0.9）相比，差异不显著（P>0.05）。10 nmol/L ATRA单独处理72小时之后，NB4细胞CD11b阳性表达率（MFI为19.2±4.2）明显提高，与对照组相比，差异显著（P
Bestatin和ATRA单独及联合处理后NB4细胞c-EBPε mRNA表达的变化
NB4细胞低表达c-EBPε mRNA。10 nmol/L ATRA处理12小时之后，NB4细胞c-EBPε mRNA表达水平明显提高，与对照组相比较，差异显著(P
Bestatin和ATRA单独及联合处理后NB4细胞c-myc表达的变化
NB4细胞c-myc mRNA呈高水平表达。10 nmol/L ATRA单独处理4小时后，NB4细胞c-myc mRNA表达下降，与空白对照组相比较，差异明显（P
Figure 4. Effect of bestatin and ATRA on the expression of c-myc mRNA of NB4 cells after treatment for 4 hours. M: marker; Lane 1: control. Lane 2: bestatin (100 μg/ml). Lane 3: ATRA (10 nmol/L). Lane 4: bestatin (100 μg/ml) +ATRA (10 nmol/L).
NB4细胞c-Myc蛋白呈高表达。10 nmol/L ATRA单独处理8小时后，NB4细胞c-Myc蛋白表达水平明显下降（P
讨 论
ATRA对APL的有效治疗是白血病诱导分化治疗的成功典范。但单用ATRA治疗易复发及产生耐药，与其他化疗药物联用时疗效有一定的提高，但毒副反应增加。因此，寻找能够增强ATRA诱导分化作用而毒副反应轻的药物，成为临床治疗中的关注问题之一［7，8］。最近，Hirano等［7］根据NBT还原实验结果提出，bestatin可能增强ATRA对NB4细胞的诱导分化作用，但未做进一步的研究。本研究通过对细胞形态、功能和表面分化抗原等多层次的检测及分析对比，表明一定浓度范围的bestatin本身不能诱导NB4细胞分化，但确能增强ATRA对NB4细胞的诱导分化作用。
Hirano等［7］认为，bestatin增强ATRA诱导分化作用可能与其抑制细胞表面CD13活性有关。本研究结果显示，与HL-60细胞相似，NB4细胞表面CD13阳性表达率高达94.79%，该药是否通过抑制CD13表达从而增强ATRA诱导NB4细胞分化的作用，尚待进一步研究证实。髓系祖细胞定向分化受转录因子活性的调节。ATRA调节与髓细胞定向分化有关转录因子的表达诱导APL细胞向中性粒细胞分化。氨基肽酶N/CD13为Ⅱ型跨膜蛋白，胞内端只有8-10个氨基酸，但最近研究报道，CD13分子能够直接参与细胞内信号转导的过程［9］。因此，本研究从药物对转录因子影响的角度对氨肽酶、抑制剂bestatin增强ATRA诱导分化作用的可能机制进行了初步探索。c-EBPε为C-EBP家族转录因子之一，ATRA诱导NB4细胞向中性粒细胞方向分化时，药物作用2小时，c-EBPε mRNA表达水平即开始增高，并持续增高至细胞终末分化［10］。而酪氨酸激酶抑制剂STI571增强ATRA诱导NB4细胞向中性粒细胞分化时，c-EBPε基因及蛋白的表达水平均未进一步增高［8］。本研究结果显示，10 nmol/L ATRA处理12小时后，NB4细胞c-EBPε mRNA表达水平明显上升，而100 μg/ml bestatin与ATRA联合处理NB4细胞时，c-EBPε mRNA表达却未进一步增强。这提示bestatin可能与STI571相似，其增强ATRA对NB4细胞的诱导分化作用可能不是通过调节c-EBPε表达。
原癌基因c-myc表达异常与髓细胞性白血病的发生有关，抑制c-myc表达可以促使白血病细胞分化及诱导细胞终末分化后的凋亡。本研究结果显示，10 nmol/L ATRA单独作用能够使NB4细胞c-myc的表达下调，这与文献报道相似［11］。同时，bestatin与ATRA联合应用时c-myc表达水平的下调作用较单用ATRA时更加明显，且药物联合应用各组细胞的c-myc蛋白表达水平与药物诱导的NBT还原能力之间呈明显的负相关。这提示bestatin可能通过与ATRA协同下调c-myc表达，从而增强ATRA诱导NB4细胞分化的作用。1，25-(OH)2 D3在诱导HL-60细胞分化时，激活蛋白激酶C，引起c-myc表达下调［12］。bestatin是否也通过激活蛋白激酶C增强ATRA下调c-myc的表达，这有待进一步研究证实。
【参考文献】
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2林茂芳，何静松，蔡真等. 氨肽酶抑制剂Bestatin 通过激活半胱天冬酶3诱导HL-60细胞凋亡. 中华血液学杂志，2001; 22: 348-350
3韩锐. 抗癌药物研究与实验技术. 北京: 北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1997： 329-330
4Zhuang WJ，Fong CC，Cao J，et al. Involvement of NF-kappaB and c-myc signaling pathways in the apoptosis of HL-60 cells induced by alkaloids of Tripterygium hypoglaucum (levl.) Hutch. Phytomedicine，2004; 11: 295-302
5谭映霞，章圣辉，尹丽慧等. 三氧化二砷和全反式维甲酸联合用药诱导NB4细胞C／EBPε mRNA和CD11b表达的初步研究. 临床血液学杂志，2004; 17: 108-110
6林茂芳，俞静，严力行. 可溶性抗CD47单抗对人树突细胞分化与功能的影响. 中华血液学杂志，2004; 25: 709-712
7Hirano T，Kizaki M，Kato K，et al. Enhancement of sensitivity by bestatin of acute promyelocytic leukemia NB4 cells to all-trans retinoic acid. Leuk Res，2002; 26:1097-1103
8Gianni M，Kalac Y，Ponzanelli I，et al. Tyrosine kinase inhibitor STI571 potentiates the pharmacologic activity of retinoic acid in acute promyelocytic leukemia cells: effects on the degradation of RAR alpha and PML-RAR alpha. Blood，2001; 97: 3234-3243
9Santos AN，Langner J，Herrmann M，et al. Aminopeptidase N/CD13 is directly linked to signal transduction pathways in monocytes. Cell Immunol，2000; 201: 22-32
