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【中图分类号】R739.8 【文献标识码】B【文章编号】1004-4949（2014）03-0456-01
1 口腔鳞状细胞癌简介
口腔鳞状细胞癌是头颈部最常见的恶性肿瘤之一，其好发部位依次为舌、牙龈、颊、腭、唇、口底。鳞状细胞癌以角化珠形成及出现细胞间桥为病理学特征。肿瘤来自表面口腔黏膜上皮，肿瘤性上皮团或上皮岛浸润下方结缔组织，细胞特征可表现为丰富的嗜酸性胞质，胞核、核浆比大，程度不同的细胞及胞核的多形性，鳞状上皮形成的角化珠和单细胞的角化均可见。OSCC占口腔颌面部癌瘤80%以上，患者5年生存率约为50%，对于肿瘤晚期和复发患者，生存率更低[1]。因此寻找有效的治疗方法十分重要。经过过去几十年的发展，手术、放疗及化疗并没有显著提高口腔癌患者的生存率，化疗药物有明显的副作用，而且对复发的口腔癌患者生存率的影响尚不明确。研究新的治疗方法显得尤为关键。
许多研究表明：恶性肿瘤的治疗中，免疫治疗一直走在前沿，口腔癌患者特别是鳞癌患者，其细胞免疫功能早期就不同程度地受到伤害，再加上常规治疗方法（手术、放疗、化疗等）又可导致机体免疫功能的进一步下降。因此，口腔癌肿的最佳治疗策略应是包括免疫治疗在内的综合疗法。随着人类基因组计划的完成和口腔鳞癌发病功能基因的不断探明，肿瘤基因治疗这一生物治疗手段越来越受到大家的认可。自从1988年Rosenberg[2]提出要将肿瘤免疫基因治疗原理实际应用于临床起，学者们就对肿瘤的免疫基因疗法展开了深入的研究。
2肿瘤免疫基因治疗的概念
广义的肿瘤基因治疗概念认为，凡是能够改变肿瘤细胞或其他体细胞的遗传物质结构或功能，而达到治疗肿瘤目的的方法均属于肿瘤基因治疗的范畴。为区别传统的化疗及放疗导致的遗传物质结构或功能（核酸）变化，将肿瘤基因治疗定义为：以适当的基因转移技术将特定的外源遗传物质导入肿瘤细胞或患者体内，通过外源遗传物质的表达产物或对宿主细胞本身遗传物质表达的影响，直接或间接地杀伤或抑制肿瘤细胞[3]。从基因操作角度看，基因治疗主要有四种方法，及基因修正、基因置换、基因失活和基因修饰。近年来，免疫基因疗法在肿瘤的治疗中得到广泛应用。
肿瘤免疫基因治疗是依赖于机体免疫功能的间接杀伤。肿瘤免疫基因治疗的定义为：根据免疫学的理论论技术建立的、以基因转移技术为基础的、以激发机体肿瘤免疫效应或提高免疫效应细胞功能为目的的基因治疗方法。免疫基因治疗的发展反映了整个肿瘤基因治疗历史，首例得到美国FDA批准的肿瘤基因治疗的临床计划是由Rosenberg[4]提出，用细胞因子基因体外转导修饰TIL，最后回输患者体内，治疗晚期恶性肿瘤病人。
3免疫基因治疗的方法
基因治疗在口腔鳞癌中的治疗前景包括用于治疗口腔鳞癌的复发和辅助治疗，例如作为外科手术后的辅助措施；发生局部远处转移的口腔癌患者也是基因治疗的应用方向之一。尽管全身用药理论上可以到达转移的病灶，但是基因治疗不适宜于全身输送。因为大多数原发和复发病灶是很表浅的，因此口腔癌患者非常适宜局部直接注射治疗。目前研究的用于治疗口腔鳞癌的方法包括：1）添加抑癌基因-基因添加疗法；2） 去除缺陷肿瘤基因-基因去除疗法；3） 减少刺激肿瘤生长的基因的表达-反义RNA；4） 增强免疫监测-免疫疗法；5） 前体药物活化起到化疗效应-自杀基因疗法；6） 病毒破坏肿瘤细胞的复制周期；7）呈送抗药基因给正常组织以防止化疗损伤。
4口腔癌癌基因的研究
迄今人们已在脊椎动物细胞中确定了32种与逆转录病毒癌基因同源的细胞癌基因，其中20多种与肿瘤发生有关。研究口腔癌癌基因的表达以及癌基因产物的形成，对从分子水平认识口腔癌的发病机制和生物学行为具有重要意义。Hoellering[5]等采用生物素化的H-ras，cDNA探针原位杂交技术和免疫组化技术，对5例口腔癌患者肿瘤组织中H-ras癌基因的mRNA及其产物P2蛋白进行定位研究，发现H-ras癌基因与mRNA的分布可能与口腔癌的生长方式及预后有关。且发现晚期口腔癌组织中均有ras和myc家族癌基因的扩增。在口腔鳞癌中，c-myc表达量较正常组高2～5倍，平均水平为0.34±0.16pg /μg，其它与口腔肿瘤有关的癌基因还有c-erb-B2、fes、mos、myb等，其中ab1基因在口腔上皮癌细胞株的表达与其脱壁生长特征有关。进一步研究口腔肿瘤中癌基因的各种变化，无疑对揭示口腔肿瘤的发生机制和指导免疫基因治疗具有重要意义。
5 口腔鳞癌的免疫基因疗法
免疫基因疗法治疗口腔癌有两种途径：一是增强肿瘤细胞的致免性，一是提高患者对肿瘤的免疫反应性。研究表明头颈部鳞癌患者有数种免疫细胞功能缺陷，包括自然杀伤细胞、T细胞、以及一些细胞因子。尽管口腔癌没有经典的免疫性，但是很多证据表明其具有免疫识别功能。已进行的动物研究包括给予IL-2诱导产生LAK细胞、TNF- A，将 IL- 2、IL- 4、IFN- C、IL-6或IL-1B转入肿瘤起到免疫调节作用联合应用非病毒脂质体表达的鼠白介素 2和多聚体表达的mIL- 12治疗口腔鳞癌，试验证明是可行并有效的[6]。mIL-2和mIL-12联合运用产生明显的抗肿瘤效应可能是由于其刺激增强了Tc细胞和NK的活性。此外，最新研究表明，应用缺陷型反转录病毒载体能够将TNF-α基因导入口腔鳞癌DNL中，带有TNF-α基因的DNL能够分泌高活性的TNF-α，表明口腔鳞癌DNL可作为基因转移的运载细胞用于口腔鳞癌的细胞因子基因治疗。
5.1 细胞因子与免疫基因治疗
在当前所开展的基因治疗研究中，免疫基因治疗的研究多集中于细胞因子基因治疗的研究。细胞因子的基因治疗避免了以往细胞因子注射疗法需反复多次给患者或动物模型注射大剂量细胞因子所带来的不良反应，也取得了细胞因子注射疗法所不具备的治疗效果。细胞因子基因治疗所选用的目的基因是可以编码表达包括ILs、IFNs、CSFs及TNFs等在内的各种细胞因子及其受体的基因[7]。依据将细胞因子基因导入体内的途径和原理不同，细胞因子基因治疗可分为以下几类：（1）以免疫效应细胞为基础的细胞因子基因治疗；（2）以瘤苗为基础的细胞因子基因治疗；（3）以抗原呈递细胞为基础的细胞因子基因治疗；（4）成纤维细胞等受体细胞为基础的细胞因子基因治疗；（5）直接体内注射途径的细胞因子基因治疗。
5.2 抗体与免疫基因治疗[8]
（1）抗体增强免疫基因治疗的靶向性：解决免疫效应细胞识别肿瘤细胞的特异性是肿瘤治疗的关键之一，研究表明将肿瘤特异性单链抗体基因导入T细胞中，使之分泌抗体，一方面通过抗体杀伤肿瘤细胞；另一方面通过抗体使特异性结合增加。
（2）抗体作为免疫基因治疗的效应分子：胞内抗体可用于肿瘤治疗。美国学者构建了一种编码单链抗体的载体（PGT21），将此载体转入高表达erbB2的卵巢癌细胞株SKOV3细胞中，可以通过胞内表达抗体erbB2单链抗体，抑制瘤细胞的生长。
（3）抗原与免疫基因治疗：在肿瘤治疗方面，经FDA批准，已有学者将编码CEA、Ig基因表达载体直接导入结肠癌和口腔鳞癌患者体内，临床显示其有一定抗肿瘤效应。
5.3 综合性免疫基因治疗
有研究表明，单一途径的免疫基因治疗效果并不理想，因此，将相互间有相加或协同效应的不同方法联合起来治疗口腔鳞癌的临床效应值得尝试。目前主要的研究方向有：细胞因子基因治疗与细胞因子基因治疗的联合；细胞因子基因治疗与B7等共刺激分子基因治疗联合；细胞因子基因治疗与MHC基因治疗联合；④细胞因子基因治疗与抗原基因治疗联合；⑤细胞因子基因治疗与自杀基因联合治疗。
6展望
综上所述，口腔颌面鳞癌免疫基因疗法发展至今，经历了从单一途径疗法转向多途径联合治疗的阶段，进一步提高了临床疗效。伴随着新的免疫基因疗法的不断问世，基因联合疗法的治疗效果更加明显，且不良反应也大大降低。同时，结合口腔鳞癌术前术后辅助疗法是可行的治疗方式，并有望进一步提高生存率。比较同期不同心的联合基因疗法的随机试验仍在进行中，这些试验将可能为治疗口腔颌面部鳞癌患者治疗中的作用确立1个新的位置。另外口腔鳞癌往往伴有第二原发肿瘤的风险，已经成为影响患者长期生存率的重要因素之一。免疫基因疗法对于第二原发肿瘤的影响如何，有待进一步研究。
免疫基因治疗是一种新兴的治疗肿瘤的方法。随着肿瘤分子生物化学研究的不断深入，我们能够拓展基因治疗肿瘤的方法，选择性针对肿瘤细胞。由于口腔鳞癌基因突变频繁，位置表浅易于瘤内给药，因此基因治疗适合运用于口腔鳞癌。基因疗法用于Ⅰ期的头颈部鳞癌是安全有效的；对于Ⅱ期鳞癌，联合放疗或化疗，也能起到抗瘤效应；作为辅助措施治疗Ⅲ期鳞癌的正在进一步研究中。以后的研究方向在于建立起安全有效的利用免疫基因疗法治疗口腔鳞癌的方法体系。
参考文献
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[4] Rosenberg SA，刘绍魁.白细胞介素-2用于肿瘤免疫疗法的最新近展[J]. 国外医学.创伤与外科基本问题分册. 1989（07）
[5] Hoellering B， Mueller MM Fusenig NE Friends or foes bipolar defects of the tumour stoma in cancer[J] Nat Rev Cancer 2004 4（2） 839 849.
肺癌是常见的恶性肿瘤之一,目前治疗是以手术、化疗、放疗为主,联合生物治疗、中医中药治疗等的综合治疗模式,但随着肿瘤分子生物学、免疫学以及分子生物学技术的发展,肺癌生物治疗不断被赋予新的内容,治疗方法逐渐扩展到基因治疗、免疫治疗以及近年来兴起的分子靶向治疗[1],为肺癌治疗开辟了更为广阔的前景。本文就肺癌生物治疗的现状及研究进展综述如下。
1 肺癌生物治疗现状
生物治疗的原理是通过为肿瘤患者补充具有杀死、抑制肿瘤能力的免疫细胞和能力,调节患者自身免疫功能,达到控制和清除肿瘤细胞的目的,主要包括细胞因子技术、基因治疗技术、肿瘤疫苗技术、免疫活性细胞继承性输注技术、单克隆抗体及其耦联物技术等[2],彼此之间并没有明确的界限,它们的出现标志着肿瘤生物治疗体系的基本形成,虽然途径与方法各异,但目的都是通过最大限度的利用人体自身所具有的抗肿瘤能力来治疗恶性肿瘤。生物治疗有自己独特的优点,毒副反应较低.仅在高剂量时有低血压、发热皮疹、抗原抗体反应等,发生率较低[3],临床上治疗肺癌应用最多的为细胞因子,免疫调节剂、基因治疗和分子靶向治疗药物也已应用于临床,过继免疫细胞中淋巴活化杀伤细胞(LAK)已见报告,为今后生物治疗的发展研究提供了丰富的内容。
2 肺癌生物治疗研究进展
2.1 分子靶向治疗肿瘤分子靶向治疗是利用分子靶向药物特异性,以肿瘤组织或肿瘤细胞中所具有的特异性分子为靶点,阻断该靶点的生物学功能,或选择性从分子水平来逆转肿瘤细胞的恶性生物学行为,从而达到抑制肿瘤生长甚至肿瘤消退的目的[4]。其中以表皮生长因子受体(EGFR)和肿瘤血管生成作为靶点的药物占60%,以表皮生长因子受体作为靶点的治疗药物包括吉非替尼、埃罗替尼、西妥昔单抗等,以肿瘤血管生成作为靶点的治疗药物包括贝伐单抗、ZD647、内皮抑素、基质金属蛋白酶等,其它靶向治疗药物如基质金属蛋白激酶(MMPs)抑制剂、血管生成因子抑制剂、法尼基转化酶抑制剂(FTIs)、环氧化酶抑制剂、组氨酸脱乙酰化酶抑制剂等分子靶向性药物正在进行临床前或临床试验研究中[5]。
2.2 细胞因子治疗 常用于肺癌的细胞因子有干扰素(IFN)、白细胞介素(IL)、肿瘤坏死因子(TNF)、红细胞生成素(EPO)和集落刺激因子(CSF)等。细胞因子的应用是目前最成熟的生物治疗方法,尤其是IFN和IL,目前已经在肺癌治疗中应用非常成熟,CSF、TNF、EPO等也逐渐被广泛应用,在肿瘤的治疗中起到了重要作用。IFN是最早发现具有抗癌效应的细胞因子,早在1980年第一次用于小细胞肺癌(SCLC)的实验中就显示出了良好的前景。IL一24是近来发现的一种新白介素,利用腺病毒转染的方法发现其可以抑制肺癌细胞的增殖并可以增强肺癌细胞对放疗的敏感性。CSF及EPO的应用对于克服骨髓抑制、预防传统放化疗所产生的白细胞下降及红细胞减少无疑起到了保驾护航的作用,为提高放化疗药物的使用剂量从而达到更好的治疗效果起到了关键作用[6]。
2.3 免疫治疗 主要包括肿瘤疫苗、过继性免疫治疗及补充细胞因子,其中发展最快的是肿瘤疫苗。目前应用的肺癌疫苗有肿瘤细胞疫苗、胚胎抗原疫苗、病毒疫苗、癌基因产物疫苗、人工合成多肽疫苗、抗独特型疫苗和树突状细胞疫苗等,树突状细胞疫苗能形成强有力的特异性细胞免疫应答,有效地清除血源性播散的肺癌细胞,发展最为瞩目[7],Ueda等应用CEA652体外冲击致敏树突细胞,治疗CEA阳性的肺腺癌患者,发现治疗后患者病情稳定,血清中CEA水平明显降低。受到重视的还有第3代疫苗:核酸疫苗,包括DNA疫苗和RNA疫苗, DNA疫苗在体内可持续高表达相应抗原,被树突细胞摄取并致敏后,激发高效的细胞和体液免疫反应,是最有潜力的肿瘤疫苗发展方向。
2.4 基因治疗
2.4.1p53基因治疗 在基因治疗研究中,以腺病毒转染抑癌基因p53的表达研究较为成功。国外对重组腺病毒介导的p53基因治疗NSCLC的临床研究已基本完成,结果显示腺病毒p53注射液在NSCLC中有抗瘤活性。一项研究中,对12例气道阻塞且无法手术的肺癌患者瘤内注射重组腺病毒p53注射液106―1011pfu,28天重复一次,其中6例患者症状得到缓解。然而也有研究者将重组腺病毒p53注射液联合化疗治疗NSClC,发现两组疗效和生存期无显著差异。
2.4.2 杀伤基因将具有杀伤作用的基因片段导入细胞复制的DNA序列中,从而打断细胞基因的连续性,抑制基因的过量表达和肿瘤细胞的增殖。自杀基因和凋亡基因通过引发肿瘤细胞的凋亡而起到杀伤肿瘤细胞的作用。TK基因-GCV系统是最有希望在临床上用于肿瘤基因治疗的方法之一,在肺癌基因治疗中具有显著作用。
2.4.3 RNAi技术 在针对肿瘤的基因治疗策略中,RNAi技术以其自身的诸多优势,在不影响正常基因功能的前提下,可以针对在细胞癌变过程中发挥重要作用的原癌基因、抑癌基因、凋亡相关基因、血管生成因子及其受体以及部分关键酶等,抑制突变基因表达或基因的过量表达。如Zhang等用HER-1 siRNA抑制了肺癌细胞A549的EGFR的表达,使肺癌细胞比对照组细胞数减少了85%,EGFR蛋白表达下降了70%以上,对顺铂的敏感性增加了4倍。
3 展望
作为一种新的治疗模式,生物治疗目前还存在很多问题,如各种治疗药物的有效性、安全性还有待于进一步评价,是否有必要采用特异性检测手段筛选分子靶向药物的适应人群来实现个体化用药,及建立这类药物与手术、放化疗之间的最佳联合方案还需不断摸索。但我们深信在不久的将来,随着对肿瘤生物学特性和行为了解的不断加深、分子药物研究的不断发展,将会出现一批新型的低毒、高效靶向治疗药物,为肺癌乃至其他所有肿瘤患者带来福音。
参考文献
[1] 马玉英.肺癌的生物治疗研究与进展[J].中国医学研究与临床,2008,6(6):35.
[2] 罗荣城,左强.肺癌生物治疗与生物化疗研究进展[J].癌症进展杂志,2006,4(6):492-496.
[3] 廖羡琳.肺癌生物治疗临床进展[J].实用肿瘤杂志,2001,16(4):221.
Abstract
AIM: To investigate the killing effects of tumor cells specific vector of suicide gene of CDglyTK driven by hTERT promoter on retinoblastoma Y79 cells in vitro.
METHODS:At first，the recombinant plasmid was transfered into Y79 cells with electroblot as a delivery system. RTPCR and Western blot analysis were used to determine the CDTK mRNA and protein expression in Y79 cells which had been transfected by pcDNA3.1CMV hTERT CDTK plasmid vector. The conversion efficiency of 5FC into 5FU in CDglyTKexpressing Y79 cells was measured by HPLC. The killing effects of double suicide genes on Y79 cells that treated with 5FC，GCV of different concentrations were determined by the method of MTT.
RESULTS:The expression of CDTK gene in Y79 cells was certificated by RTPCR and Western blot and a 59kD protein was obtaind which was equal to the sequence expection of CDTK gene. In MTT analysis，there was significant difference between transfected and nontransfected survival Y79 cells(P
CONCLUSION:The recombinant plasmid vector pcDNA3.1CMV hTERT CDTK can be transcribed and translated into CDTK fusion protein in Y79 cells.The transfer of the CDglyTK fusion gene into Y79 cells followed by the administration of 5FC or GCV can kill Y79 cells in vitro. The killing effect of two predrugs is stronger than that of one predrug.
KEYWORDS: CDglyTK gene; retinoblastoma;suicide gene therapy;5FC; GCV
自杀基因治疗是近年来肿瘤研究的热点领域之一，也是目前最有可能有效应用于临床的肿瘤基因治疗策略之一。构建安全高效的载体是基因治疗的关键。我们已经成功的构建了含有hTERT启动子的肿瘤特异性杀伤载体pcChCDTK[1]。我们将探讨该载体对人视网膜母细胞瘤Y79细胞在体外的作用。
1材料和方法
1.1材料
Y79细胞株[美国模式菌种收集中心(ATCC)];RPMI1640细胞培养基(Gibco);胎牛血清(Gibco);5FC，5FU，GCV(Sigma);Reverse Transcription system kit(Invitrogen);Trizol(Gibco); QIAfilterTM plasmid Maxi kit(Qiagen); Triton X100(CalBiochem); ECL试剂盒(Amersham pharmacia biotech); PVDF膜(Amersham pharmacia biotech);双丙烯酰胺(BioRad); MTT(Sigma);鼠TK mAb(QED公司);兔抗鼠IgG二抗(KPL公司);蛋白质Marker(上海生化试剂公司);实验所用引物 (上海生工生物工程有限公司)：yCDrt：5’ACGCTGTGTTGTCGGTGAGAA3’;TKrt：5’CAC CACCACGCAACTGCTG3’;βactin F：5’CACCCTGAAGTA CCCCATCG3’;βactin R：5’TTGCCAATGGTGATGACCTG3’。
1.2方法
将经过证实的含有pcChCDTK质粒的JM109菌液0.2mL接种到200mL含50mg/L氨苄青霉素的LB培养基中，37℃，280r/min的摇床上培养16h，将菌液转移到离心瓶中。然后按照QIAfilterTMplasmid Maxi kit提供的步骤进行操作提取质粒pcChCDTK，干燥后，加无菌水溶解质粒300μL，用Duc 640分光光度计测定DNA含量，20℃分装保存。用RPMI1640培养液培养Y79细胞，每日在倒置相差显微镜下观察。Y79细胞悬浮生长，培养中细胞可聚集成团并沉集于培养瓶底部，当细胞基本铺满瓶底即可传代，按照1∶2～1∶4传代。将传代后的Y79细胞培养24h后，细胞进入对数生长期，即可用于电转化。未转染Y79细胞生长迅速，传代后培养24h后，细胞进入对数生长期。取上述进入对数生长期并基本铺满瓶底的细胞，在22℃，1000r/min的条件下，离心10min，收集细胞。用0.01mol/L PBS 10mL重悬细胞，取细胞悬液20μL，用细胞计数板计数，其余细胞在22℃，1000r/min条件下，离心10min，重新收集细胞;根据计数结果，用0.01mol/L PBS以6.25×109/L的密度重悬细胞。取800μL细胞重悬液加入到含有pcChCDTK质粒20μg的EP中，吹打混匀，然后转入0.4cm的电击杯中，以2kV，25μF的条件进行电击。电击后，迅速将电击产物分至已加入10mL 200mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液的75cm2培养瓶中，置37℃，50mL/L CO2的细胞培养箱内培养。电转染后的Y79细胞生长与未转染细胞相似。倒置相差显微镜下见细胞悬浮生长，形状饱满，色泽鲜亮，聚集成团。
1.2.1 CDTK基因表达的检测
提取Y79细胞RNA;参照reverse transcription system kit进行RTPCR反应;取逆转录产物2μL作为模板，以yCDrt和TKrt为引物扩增CDTK，同时用βactin扩增引物作对照，RTPCR产物用8g/L琼脂糖凝胶跑胶检测。另取未转染的Y79细胞设为对照，同法处理。取转染48h和未转染的Y79细胞预处理;固定玻片;配制分离胶和堆积胶;上样;跑胶;转膜;封闭;加一抗;洗一抗;加二抗;洗二抗;显色;曝光。
1.2.2 5FU浓度的检测
人视网膜母细胞瘤细胞株Y79用含200mL/L胎牛血清RPMI1640培养液在37℃，50mL/L CO2细胞培养箱中正常培养。细胞在转染肿瘤特异性杀伤载体pcChCDTK前24h换液，调整细胞密度使之在转染时达基本铺满瓶底。将细胞在22℃，1000r/min的条件下，离心10min，收集细胞，用适当体积的无血清的RPMl1640培养液重悬，细胞计数，使之密度为6.25×109/L。取细胞悬液800μL加入自杀基因载体pcChCDTK 20μg，将其混匀，转入0.4cm的电击杯中，以2kV，25μF的条件进行电击。电击后，细胞接种入培养瓶中培养，24h后收集细胞并用1×PBS洗3次，然后用含200mL/L胎牛血清的RPMl1604培养液配成细胞悬液，以每孔2×105个细胞的浓度植入24孔板，每孔培养液体积1mL。24h后加入前体药物5FC(200mg/L)。在加5FC 24h后取其细胞上清，用高效液相色谱仪(HPLC)检测其5FU的浓度。配5FC及5FU标准品的浓度梯度做标准曲线。LC10A高效液相色谱仪;分析柱: Shimpack CLCODS(5μm，150mm×4.6mm，ID);预柱YWGODS(10μm，10mm×4.6mm，ID);流动相：甲醇/水(20/80);流速1mL/min;检测波长266nm;柱温37℃。10μL进样。
1.2.3前体药物对细胞毒性的检测
采用Western Blot技术检测新融合自杀基因CDTK在视网膜母细胞瘤Y79细胞中的蛋白质水平表达。人视网膜母细胞瘤细胞株Y79用含200mL/L胎牛血清RPMI1640培养液在37℃，50mL/L CO2细胞培养箱中正常培养。以2×105个细胞的密度将细胞接种到96孔板中培养，每孔体积200μL。24h后，加入不同浓度的前体药物100μL，即5FC以0，25，50，100，200，400，800mg/L;GCV以0，2，4，8，16，32，64mg/L加入96孔板。每个浓度梯度有4孔。留1孔不加细胞，只加培养液做空白对照孔。在37℃，50mL/L CO2的条件下，细胞不换液培养5d后，每孔加入(5g/L) MTT溶液20μL，37℃，继续孵育4h，终止培养，吸去培养上清液。每孔加入DMSO 150μL，振荡10min，使结晶物充分溶解。比色：选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上调定各孔吸收值。以每天进行换液的细胞做对照，假设细胞存活率为100%，将其它各细胞孔的吸收值与其比较得出各处理组细胞的平均存活率。另视网膜母细胞瘤细胞在转染前24h换液，调整细胞密度使之在转染时达基本铺满培养瓶底。将pcChCDTK载体电转染Y79细胞。电击后，细胞接种入培养瓶中培养，24h后，收集细胞并用0.01mol/L PBS洗3次，然后用含200mL/L胎牛血清的RPMl1604培养液配成细胞悬液，以每孔2×105个的密度植入96孔板中培养，每孔体积200μL。24h后加入不同浓度的前体药物100μL，5FC+GCV以两药的对应浓度加入96孔板，每个浓度梯度有4孔。留一孔不加细胞，只加培养液做空白对照孔。然后用MTT法检测细胞存活率。统计学分析：所得数据用SPSS 11.5统计软件包进行统计，采用StudentNeuman Keuls(SNK)检验，以P
2结果
2.1 Y79细胞转染后CDTK基因的表达
RTPCR检测结果显示，转染组可见一403bp特异条带，与预期大小一致(图1)。而在未转染的对照组细胞中，未扩增出403bp特异条带。在两组中均扩增出作为内对照的βactin产物561bp条带。分析结果显示：大小为42kD的内参βactin蛋白条带在转染和未转染的Y79细胞中均可见，一个大小为59kD的条带，在转染了pcChCDTK载体的Y79细胞中可见，这与yCDTK基因序列分析的预期蛋白大小一致，为自杀基因yCDTK蛋白。未转染pcChCDTK的Y79细胞中则没有59kD的条带出现(图2)。
2.2 Y79细胞转染后5
FC转化效率 加5FC 24h后上清中5FU的浓度平均含量为169mg/L，5FC向5FU的转化效率约为84.5%。
2.3前体药物对Y79细胞的毒性
将生长良好的人视网膜母细胞瘤Y79细胞，按每孔2×105个细胞接种到96孔板中培养。加入不同浓度的前体药物5FC培养5d，平均细胞存活率分别为98.2%，94.7%，90.5%，88.2%，89.4%，86.4%和83.9%。SNK检验表明，各梯度间的细胞存活率存在显著性差异(P
2.4前体药物对用肿瘤杀伤载体转染的人视网膜母细胞瘤细胞的毒性检测
将电转了pcChCDTK的人视网膜母细胞瘤细胞，按相同的密度将细胞接种到96孔板中培养。加入不同浓度的前体药物5FC培养5d，平均细胞存活率分别为94.0%，91.6%，85.1%，80.0%，72.7%，69.9%和62.7%。SNK检验表明，各梯度间的细胞存活率存在显著性差异(P
3讨论
目前，相对于传统的视网膜母细胞瘤(retinoblastoma，RB)治疗方法而言，RB基因治疗不仅可以弥补光凝固治疗、光动力学治疗、温热治疗、冷冻治疗的应用局限性，而且不会产生诸如化学治疗、放射治疗的副作用，更不会因为眼球摘除所导致的致残性而造成患儿心理障碍影响生图1RTPCR产物凝胶电泳图 M:DL2000 Marker;1:转染组可见预期的CDTK(403bp)目的片段和βactin(561bp);2:未转染组;3:阴性对照。图2Western Blot检测CDTK的表达 A：1，2:βactin(42kD);B：1:转染pcChCDTK的Y79细胞，出现一条约59kD蛋白;2:未转染的Y79细胞。
存质量。因此，RB基因治疗的研究越来越为人们所重视，并且通过不同的治疗策略取得了一系列的研究进展。现阶段对RB基因治疗的研究主要集中在4种不同的基因上，包括自杀基因、抑癌基因、抗血管生成基因以及促凋亡基因。RB发生的分子机制还不是太清楚，而且与RB形成相关的抑癌基因凋亡诱导基因种类繁多，与肿瘤血管形成相关的诱导因子和抑制因子多种多样，且分子机制仍有待于进一步研究。我们选择双自杀基因CDTK作为目的基因，实施RB的自杀基因治疗。首先，自杀基因作为肿瘤基因治疗的候选基因，已经在多种肿瘤开展研究[27]。其表达产物和前体药物相互作用来实现肿瘤基因治疗的机制比较清楚。其次，自杀基因和前体药物相互作用产生的毒性物质能通过不同方式实现对邻近肿瘤细胞的旁杀效应，包括直接分泌到细胞外旁杀，或通过细胞间隙连接旁杀，或通过产生凋亡小体、免疫介导来实现旁杀。同时，目前的研究表明，自杀基因系统治疗RB是安全有效的[8]。我们设计的含有双自杀基因CDTK的载体通过电转染的方式导入了视网膜母细胞瘤细胞株Y79细胞。48h后，提取转染Y79细胞RNA，RTPCR的结果可见一403bp特异条带，与预期大小一致，显示双自杀基因CDTK在细胞中mRNA水平得到了表达。Western blot的结果也同样显示，载体转染的Y79细胞中，59kD的目的基因蛋白有明显的表达。这两个实验结果充分说明，我们构建的双自杀基因CDTK在靶细胞Y79中得到表达。先前的研究显示，被设计得的融合基因yCD/UPRT、大肠杆菌CDglyTK以及yCDglyTK具有最强的催化前体药物向细胞毒物转化的能力。我们通过HPLC检测5FU的浓度，上清中5FU的浓度平均含量为169mg/L，故5FC向5FU的转化效率约为84.5%，说明我们所构建的肿瘤特异性双自杀基因载体具有很强的催化前体药物向细胞毒性物质转化的能力。
双自杀基因疗法是将两种自杀基因整合在一起，通过载体转导进入肿瘤细胞，其在肿瘤细胞内表达的融合基因产物具备两种酶的活性。因此，双自杀基因疗法可以大大提高抑制肿瘤生长的功效，同时使得前体药物的用量减半。大量资料表明双前体药物对肿瘤细胞的杀伤作用要强于单前体药物。但也有资料显示双自杀基因之间可能存在拮抗效应。在体外实验中，单独加5FC的细胞杀伤最强，要高于5FC和GCV都加的组，而单独加GCV的细胞杀伤力最低， CD和TK之间没有协同作用，反而可能会相互干扰各自功能的运行。原因可能有两个方面：(1)可能是融合基因yCDglyTK在同时加5FC和GCV时，CD/5FC和TK/GCV两种系统的功能出现拮抗效应;(2)可能是在yCDglyTK融合基因中，由于某种原因，CD和TK的活性在这个融合基因中得到提高，使CD/5FC和TK/GCV两种系统的抑瘤能力同时或其中一种得到增强。当E.coli CD和HSV1 TK基因同时在一种细胞中表达时，会存在相互干扰作用。这种干扰作用的机制到目前还没搞清楚，但干扰作用可能不是发生在基因的转录期，而是在转录之后，TK介导的5FUMP的磷酸化会产生无毒的5FdUDP和5FdUTP，而不是毒性产物5FUDP和5FUTP，从而减低了CD/5FC的细胞毒性作用;或者CD介导的对GCV，ACV等的脱胺反应减低了TK/GCV系统的细胞毒性。yCD/UPRT基因中UPRT的酶活性与单独的UPRT酶活性大致相等，但是yCD/UPRT基因中的CD酶活性要高于单独CD酶活性100倍。这种酶活性的改变可能与这3种酶的蛋白质特性不同有关。加入不同浓度的前体药物5FC，GCV或5FC+GCV于电转了pcChCDTK的人视网膜母细胞瘤Y79细胞培养5d， SNK检验表明，与未转染的细胞对应浓度组比较，当5FC浓度达到100mg/L后各对应浓度平均细胞存活率组间均存在差异(PGCV >5FC。在本实验中，单前体药物对双自杀基因CDTK载体转染的Y79细胞均有杀伤作用，但双前体药物的杀伤作用要强于单前体药物。分析产生这种结果的原因，我们认为：(1)双自杀基因载体具有很强的催化前体药物向细胞毒物转化的能力;(2)这可能与我们加入的CMV增强子能大大促进hTERT启动子启动下游目的基因的表达有关，因为CMV增强子具有强大的增强转录能力，且没有组织特异性。
参考文献
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【关键词】 肝癌；腺病毒； p53；基因治疗
〔Abstract〕 Objective To explore the potential use of adenovirus mediated p53 gene (Ad-p53) therapy for hepatocellular carcinoma.
Methods A human hepatocellular carcinoma cell line HepG2 was used. Recombinant adenovirus carrying wild-type p53 gene was transfected into HepG2 cells in vitro and injected into tumor nodules in vivo. The growth of HepG2 cells in vitro and established hepatocellular carcinoma nodules in nude mice was examined. Cell apoptosis was analysed by Annexin-V/PI labeling flow cytometry method.
Results
Cell growth was greatly suppressed at ≥ 125MOI. p53 transfection can increase HepG2 cells apoposis rate. In vivo studies， intratumoral injection of Ad-p53 significantly inhibited hepatocellular carcinoma implanted xenograft.
Conclusion
Transfection of wild-type p53 gene via Ad-p53 is a potential approach to the therapy of hepatocellular carcinoma.
〔Key Words〕
Kepatocellular carcinoma; Adenovirus; p53; Gene therapy
原发肝细胞性肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，因其恶性程度高、预后差，目前临床采用的多种传统治疗手段都不能收到满意的效果。p53 基因在肝癌细胞中的突变率达 50% 以上[1]，是肝癌细胞中突变频率最高的基因，因此成为肝癌基因治疗的最佳靶点之一。腺病毒 DNA 不整合到宿主细胞基因组中，对人体无遗传毒性，作为基因载体既可感染处于分裂状态的细胞，也可感染静息期细胞。本研究旨在探讨重组人 p53 腺病毒（Ad-p53）对人肝癌 HepG2 细胞的抑制作用，现报道如下。
1
材料与方法
1.1
材料
重组腺病毒介导 p53 基因（Ad-p53）由深圳市赛百诺基因技术有限公司提供，对照病毒 Ad-LacZ 由中山大学医学院伍庄博士惠赠。人肝癌细胞株 HepG2（内源性表达野生型 p53）由中山大学医学院伍庄博士惠赠，细胞在 RPMI-1640 培养基传代培养。5~7 周龄 BALB/c 裸鼠，雌性，体重 18~21 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于无菌塑料透明隔离器内，动物实验时严格无菌操作。
1.2
MTT 法检测病毒感染滴度与细胞存活的关系
将 HepG2 细胞按每孔 500 个细胞分别接种于 96 孔板内，第 2 天用 Ad-p53 分别以 10、25、50、75、100、125、150 效靶比（multiplicity of infection， MOI）感染细胞，对照组不加药，每一 MOI 值重复 6 孔。37℃，5% CO2 饱和湿度培养箱中培养 10 h 后弃去病毒感染液，换新鲜培养液，每孔加入 50 g MTT，孵育 4 h 后二甲基亚砜（DMSO）终止反应，酶标仪测定光吸收度。
1.3
MTT 法检测病毒感染时间与细胞存活的关系
将 HepG2 细胞按每孔 500 个细胞分别接种于 96 孔板内，第 2 天用 Ad-p53 以 125 MOI 感染细胞，对照组不加药，每一时间值重复 6 孔。37℃，5% CO2 饱和湿度培养箱中分别培养 30、60、90、120、150 min 后弃去病毒感染液，换新鲜培养液，24 h 后换新鲜培养液，每孔加入 50 g MTT，孵育 4 h 后 DMSO 终止反应，酶标仪测定光吸收度。
1.4
台盼蓝染色绘制细胞生长曲线
将 HepG2 细胞 1×105 接种于 60 mm 的平皿，培养到约 70% 汇合，细胞计数，吸出培养液，125 MOI 值的 Ad-p53 和空载体腺病毒 Ad-LacZ 感染 HepG2 细胞，设空白对照，每天观察细胞生长状况，于感染的 2、4、6、8 d，用 2.5 g/L 胰蛋酶消化细胞，离心收集细胞，台盼蓝染色，细胞计数，每皿重复 3 次，取平均值，绘制细胞生长曲线。
1.5
Annexin V/PI 双染色法检测细胞凋亡
分别取 5×105 个对数生长期 HepG2 接种于 6 孔板， 125 MOI 值的 Ad-p53、Ad-LacZ 及 PBS 作用 24 h 后收获细胞，每个标本加入 Annexin V 2 L、PI 荧光抗体 2 L，室温避光双染色 15 min，加入 400 L 结合缓冲液，上流式细胞仪检测分析，获得标记阳性的细胞，计算细胞凋亡率。
1.6
Ad-p53 对裸鼠移植瘤生长的抑制作用
HepG2 细胞在 37℃，5% CO2，含 10% 小牛血清的 RPMI-1640 的培养基中培养，将处于对数生长期的细胞用 0.25% 胰蛋白酶消化，用无菌 PBS 液重悬制成 5×107/mL 的单细胞悬液，每只裸小鼠于右侧后肢外侧皮下接种 0.2 mL (1×107)细胞悬液，共 18 只。接种 6 d 后，将荷瘤裸鼠随机分为 3 组，每组 6 只，于肿瘤结节（或肿瘤接种部位）内分别注射 0.1 mL 的 PBS 液或含有 5×107 pfu 的 Ad-LacZ、Ad-p53。每隔 3 d 注射 1 次，共注射 5 次，每次注射前测量肿瘤体积。游标卡尺测量肿瘤结节的长度（a）和宽度（b），按公式 V=ab2/2 计算肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线。
1.7
统计学处理
实验结果以 x±s 表示，采用SPSS 10.0 统计软件进行配对 t 检验。
2
结
果
2.1
病毒感染滴度与细胞存活的关系
与空白对照相比，Ad-p53 对 HepG2 细胞有明显抑制作用，随着 MOI 的增加，野生型 p53（wild type- p53，wt-p53）对细胞的抑制作用逐渐增强，当病毒量为 125 MOI 时，HepG2 细胞基本达到完全抑制（图 1）。
2.2
MTT 法检测病毒感染时间与细胞存活的关系
Ad-p53 对 HepG2 细胞的抑制作用与病毒感染时间有关，随着感染时间的延长，wt-p53 对细胞的抑制作用逐渐增强。当感染时间达到 120 min 时，HepG2 细胞基本达到完全抑制（图 2）。
2. 3
Ad-p53 对肝癌细胞生长抑制的检测
125 MOI 值的空载体腺病毒 Ad2LacZ 对 HepG2 细胞的生长影响与对照组相比没有差别，而以 125 MOI 值的 Ad-p53 感染 HepG2 细胞能对细胞生长产生明显抑制（P < 0.01，图 3）。这一结果表明，对肿瘤细胞的抑制作用来自转导的野生型 p53cDNA，而不是缺陷腺病毒载体本身。
2.4
Annexin V/PI 双染色法检测细胞早期凋亡
125 MOI 值的 Ad-p53、Ad-LacZ 及 PBS 作用于 HepG2 细胞 24 h 后，细胞早期凋亡率（Annexin V+/PI-）和细胞总凋亡率（Annexin V+/PI-与 Annexin V+/PI+之和）结果见表 1。
2.5
Ad-p53 对裸鼠移植瘤生长的抑制作用
所有 18 只裸鼠均成活，3 组裸鼠给药前体重和肿瘤体积经统计学分析组间均无显著性差异（P > 0.05），表明各组裸鼠体重和肿瘤体积在治疗前均衡性好。在细胞悬液接种后的第 6 天，各个接种点均可见实体肿瘤结节，直径 0.4~0.6 cm。裸鼠荷瘤瘤体内注射PBS 和 Ad-LacZ 后，体积仍持续增大；相反，注射Ad-p53 后肿瘤的生长即受到十分明显的抑制（图 4）。当实验结束时，与 PBS 注射组相比，Ad-LacZ 组肿瘤体积并未见显著降低（P > 0.05），而 Ad-p53 组的肿瘤生长幅度均受到明显的抑制，平均体积较PBS 组（P < 0.01）和 Ad-LacZ 组（P < 0.01）显著降低。
转贴于
3
讨
论
p53 基因是正常细胞内关键的看家基因，是最重要的一个抑癌基因。其通过以下作用实现抑癌作用：①细胞周期阻滞、促进损伤细胞修复[2]；②诱导严重受损细胞凋亡[3]；③调节机体免疫反应；④抑制生存增殖信号途径[4]；⑤ 抑制血管生成及物质能量代谢；⑥ 抑制细胞-细胞黏附及其浸润转移。p53 基因异常而失去上述抗细胞增殖、促凋亡功能时细胞极易发生异常增生和癌变。可引起 DNA 损伤的放射线、化学剂和热，都产生细胞周期阻滞和诱导凋亡，正常功能的野生型 p53 基因即促进这些效应，p53 基因缺失或变异即减弱甚至破坏了这些效应。人类肿瘤的 50% 以上都存在 p53 变异而功能失常，从而降低了治疗的疗效。抑癌基因治疗是将正常的肿瘤抑制基因导入肿瘤细胞可代替和补偿缺陷的基因，以抑制肿瘤的生长，这是从根本攻克肿瘤的关键环节。p53 基因是与人类肿瘤相关性最高的抑癌基因，是肿瘤基因治疗的重要靶点之一，通过导入野生型 p53 来重建细胞内变异的 p53 已成为肿瘤治疗的新策略，是当前研究的热点。实验证实，野生型p53 的导入对多类肿瘤产生明显的抑制作用[5-7]。
本实验观察到以腺病毒为载体的 wt-p53 导入对肝癌细胞生长产生明显抑制。发现 Ad-p53 的抑制作用与感染浓度及感染时间有关，随着感染浓度的增高，抑制作用逐渐增强，当 Ad-p53 对癌细胞在感染浓度 100 MOI 时能基本达到完全抑制。Ad-p53 感染时间越长，抑制作用越明显，当感染时间达到 120 min 时，HepG2 细胞基本达到完全抑制。通过与重组腺病毒 Ad-LacZ 对照，表明此抑制作用来自野生型p53 基因的表达，而不是重组腺病毒本身。在体外实验的基础上，我们观察了 Ad-p53 对荷瘤裸鼠肿瘤生长的作用，体内实验显示经 Ad-p53 注射的肿瘤结节生长受到了明显的抑制，Ad-p53 实体瘤局部注射是可取的治疗方案。国内外在肺癌、头颈部癌、胶质瘤等肿瘤的Ⅰ或Ⅱ期临床试验已初步证明[7-10]，它不仅对一些肿瘤有治疗效果，而且未发现有明显的毒副作用。
本研究结果证实：无论用细胞培养转染还是种植瘤内注射的方法，都显示了 Ad-p53 对肝癌细胞的抑制作用，为临床应用 p53 基因治疗肝癌提供了可靠的实验依据。
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肿瘤是机体中正常细胞在不同始动与促进因素长期作用下,所产生的增生与异常分化形成的新生物。随着疾病谱的改变，肿瘤已成为目前导致死亡的常见原因之一，随着现代科学技术的发展和突飞猛进，给科学技术方法研究带来革命性变化，肿瘤逐渐地被看成为一种全身性疾?S纱硕矗琢鲋瘟乒勰畋惴⑸嗣飨缘淖颍琢鲎酆现瘟葡低彻塾υ硕＜创酉低彻鄣慕嵌雀莶∪说幕遄纯霾±聿∑谟敕⒄骨魇?有计划地、合理地综合应用现有的各种治疗手段,以期较大幅度地提高病人的生存率,改善病人的生存质量。
1肿瘤发生、发展的系统观
所谓系统是指若干要素按一定的结构相互联系组成具有特定的功能的有机整体，而这个整体本身又是它所从属的一个更大系统的一个组成部分。系统科学的观点，就是要求把研究对象视为系统，把事物的普遍联系和永恒运动看成一个整体过程，全面的把握和控制，综合的探索系统中要素与要素、要素与系统、系统与环境、系统与系统的相互作用和变化规律，把握住对象的内环境与外环境的关系，以便有效地认识和改造对象［1］。任何系统都是开放的系统，每一个系统的存在都有整体性、层次性及动态平衡性等基本特征。一个生物学意义上的人，也完全可以看成是一个开放系统。这一系统本身就由各个子系统（循环、呼吸、消化等系统）组成，各系统之间并非独立存在，有相互影响、相互制约的作用关系，这一大系统和外界进行不断的物质和能量的交换，借以维持自身的稳态，达到功能的最优化，即生存质量最佳化。所以有学者认为：决定疾病发生发展的，不仅仅在于器官、组织、细胞、基因等各种要素的性能，更重要的是要素和要素之间，系统和环境之间的相互联系和作用，考察疾病的本质，必须把注意和焦点放在相互联系和相互作用上［2］。上述说法就是从系统水平进行考察，而不同局限于单个细胞或基因的功能行为。那么，在肿瘤的发生学上，是否肯定“基因决定论”的观点呢？近几年的研究提出，细胞基因的缺失、突变等导致的细胞生长失控、恶变是发生肿瘤的主要机制。从分子水平看，肿瘤的病因主要有癌基因的激活和抑癌基因的失活，细胞周期调控基因的改变，前者是发病的基础，并通过后者发挥作用。但对于这么一个子系统（核酸系统）的考察，并不能完全解释肿瘤的发生。核酸系统之间，核酸与蛋白质系统之间，核酸与神经-内分泌系统之间，核酸与内、外环境之间均存在着千丝万缕的联系。癌基因的激活和抑癌基因的失活并不会无缘无故发生，研究已表明，肿瘤的发生和发展是一个多基因、多步骤、多因素的渐进过程。环境污染致癌因素的刺激，化学致癌因素如苯、氯霉素、亚硝酸胺的影响，物理致癌因素，肿瘤的病毒病因，其他如人体内分泌失调、遗传、慢性刺激和创伤均可致瘤。而且单因基因突变而产生的肿瘤细胞也未必能发展成肿瘤，在人体这样一个复杂的系统中，神经-内分泌-免疫等内环境随时进行警惕的监视，只有整个大系统紊乱，监视功能障碍，肿瘤细胞才能逃脱系统监视，才能进一步发展。而真正发展到器官的癌变，往往要经历数年甚至几十年的时间，因为一旦系统的功能恢复正常，肿瘤细胞可被机体清除，只有在内外环境的反复作用下，机体各系统功能的紊乱无法再协调一致，才使得肿瘤得以发展甚至转移。综上所述，肿瘤的发生和发展并非“基因决定论”可以完全解决，相反的，只有从系统的整体的水平去考察外界环境和机体的作用，机体自身各个子系统的相互作用，每个子系统内部各要素的相互关系，才能很好地认识其病因和发病机制。
2系统方法论原则对肿瘤治疗的思路指导
进入20世纪之后，医学渐渐进入理性阶段。随着对肿瘤本质认识的不断深入，更由于肿瘤局部治疗方法的停滞不前，局部治疗后预后不佳，使更多的学者意识到局部治疗的弊端。20世纪80年代，恶性肿瘤的治疗方式有手术、放疗、化疗、生物治疗，其中以根治性手术为主，对失去手术机会的中晚期恶性肿瘤只通过单一的放疗或化疗来延长生存期，有效率低，易于复发，治疗手段单一。80年代后期，由于化疗药物的不断推陈出新，肿瘤学理论的不断完善，化疗的地位日益被重视，发展了诱导化疗、术后化疗、放化疗、热化疗等各种综合治疗模式，手术方式也由根治性手术向保守性手术、保留器官功能方向发展，因此，21世纪的肿瘤治疗更注重强调根据病人的身体状况、肿瘤的病理类型、侵犯范围（病期）和发展趋向，有计划合理地应用现有的治疗手段，以期较大幅度的提高治愈率，改善病人的生活质量，肿瘤治疗观念由此发生了根本性的转变，肿瘤综合治疗应运而生［3］。所谓肿瘤综合治疗是指：根据病人的机体状况，肿瘤的病理类型，侵犯范围（病期）和发展趋势，有计划地、合理地应用现有的治疗手段，制定个体化治疗方案，以期大幅度地提高治愈率，改善病人的生存质量［4］。可以说，肿瘤治疗学研究显示出多学科的合作与补充，肿瘤的治疗也已进入综合治疗的时代。按照系统论整体性原理来讲即系统论中各组分相加的和大于各组分的代数和。恶性肿瘤综合治疗个体化的决策，将手术、化疗、放疗、中医中药治疗及生物基因治疗，依照不同病例特点，进行有机组合，以期达到最佳的治疗效果［5］。但它不是将各种治疗手段的简单叠加或随意轮番应用，孰先孰后，孰轻孰重，均要因人而异，要经过多学科的充分讨论协商后决定。在决策过程中，既要注意尽量避免盲目一味强调某一学科在肿瘤治疗中的重要性和单一治疗方法在肿瘤治疗中的过分扩大应用，又要注意各个学科之间的密切合作，相互配合，互补应用，共同来承担对患者的综合治疗。这就要求无论是哪一个学科的医生，都要做到不仅能够了解自己本学科治疗手段的特点和不足，还要了解其他相关学科治疗手段的特点和不足，真正做到心中有数。要能够善于应用其他相关学科的成果和特长来对自己本学科的治疗加以充实、完善和提高。特别是在科学技术迅猛发展和技术更新速度不断加快的今天，及时了解并掌握专业技术的发展动态和引进先进技术并加以应用与创新，以跟上时代和科技发展的步伐。当前，越来越多的肿瘤病人首诊时都选择到肿瘤内科，主要是因为肿瘤内科的医生能够善于接受和利用新的医学研究成果，以病人利益为重，改变过去谁先接诊谁收治的不规范医疗行为，在对肿瘤病人的诊断以及设计和规划总体治疗策略上起到了主导作用，不仅能够使肿瘤病人真正享受到现代肿瘤综合治疗模式与治疗方案个体化所带来的益处，而且也充分体现了社会的文明进步与人文关怀［6～13］。我们在临床工作中必须要按照医学伦理学“医乃仁术”和“循证医学”，谨慎、准确和明智地应用当前所能获得的最好的研究证据，结合个人的专业技能和多年的临床经验，考虑病人的经济承受能力和意愿，并将此结合最优化的原则来作出具体的治疗决策。例如目前放化疗综合治疗的临床应用多集中于头颈部癌、食管癌、乳腺癌以及肺癌中，通过放化疗综合治疗所获得的较高的局控率和较晚发生远处转移，为我们提供了一条中晚期恶性肿瘤治疗的新途径。静脉化疗起到了全身治疗的目的－在于彻底清除微小转移灶，放疗作为一种局部治疗，二者联合应用的优点不言而喻，中晚期恶性肿瘤传统的单一治疗模式已远远不能适应目前临床要求，放化疗综合治疗不仅提高生存率，对延缓发生远处转移也显示出了不可比拟的优越性，尤其是同期放化疗的应用将中晚期恶性肿瘤的治疗带上一个新的台阶［14］。
随着分子生物学技术的发展，作为生物医学前沿的人类基因组计划研究步入实质性阶段，基因治疗肿瘤成为热门。基因治疗能否给人类带来巨大的革命，已成为现代医学大家的研究方向。所谓基因治疗是指把目的基因导入靶细胞和宿主体内，通过基因组合，成为宿主遗传物质的一部分，纠正错误的基因表达和基因表达的错误，以达到治疗的目的［15］。通常包括四方面的内容：基因修正-纠正缺陷基因的突变碱基序列；基因置换-由正常基因换掉疾病基因；基因修饰-将目的基因导入病变细胞的基因，其表达产物用以修饰缺陷基因导致的细胞功能异常，或使正常功能得以加强；基因失活-应用反义技术封闭不该表达的基因，以抑制有害基因，或直接抑制有害基因的表达。虽然就基因治疗的概念来说，体现的是分子水平的基本理论和原则，但其治疗的目的是为了抑制肿瘤的生长或达到逆转、杀死肿瘤细胞，所以在治疗过程中仍需考虑所作用的个体系统，如外界的环境因素，机体的内环境和免疫功能的影响等。因为将基因导入细胞，使正常基因得以表达，或使病变基因不表达，或诱导已有的肿瘤细胞分化、凋亡，都不是单单一个分子水平可以解决的。例如将反义基因导入细胞，以封闭有害基因的表达，在体外实验中，所要观察的指标限于细胞水平，如基因转染的百分率，对肿瘤细胞生长和抑制率等。但一旦进入体内实验阶段，就不能不考虑机体的整体性，如反义核苷酸对肿瘤细胞有抑制作用，那么对正常细胞或组织器官是否有毒性作用呢？在体内，在各种调节机制的作用下或各种核酸酶等水解酶的作用下，反义核苷酸是否能成功地进入细胞封闭有害基因呢？再如用逆转录病毒载体介导的基因转移有效性高并容易获得稳定表达，但这一插入突变是否会引起潜在的癌基因激活，从而又引发新的肿瘤呢？显然，在肿瘤的基因治疗的研究中，在体外细胞水平中有良好的效应，但进入机体系统中，其效果不一定良好，而且历史上也有基因治疗失败的例子。这正是因为人体是一个复杂的系统，各个子系统之间有复杂的相互关系，而肿瘤的发生和发展也并非由基因单独决定，如果单从基因这一方面去考虑，而忽略了治疗所处的整体环境，忽略了治疗应采取的整体措施，往往会导致实验的失败。任何对肿瘤疾病的治疗方法需经过人体内试验，要从系统和整体的水平观察治疗有效性和可能存在的副作用，肿瘤基因治疗也需遵循系统观点，用整体性、动态性、联系性的原理，达到最佳的预期效果。但在实际工作中，尚有许多疑难问题，对于这些问题解决离不开系统科学观的支持，我们不能忽视机体的整体性，不能用局限、部分、分子细胞水平来以偏概全，只有用系统的环境中解决这些难题，才会有实用价值和临床价值。所以从肿瘤的综合治疗可以看出，综合手术、化疗、放疗及生物基因治疗、中医中药治疗、内分泌治疗等手段，依据具体情况具体分析的原则，针对具体的病例，制订相应的个性化的治疗方案，最终达到最佳综合疗效，在某些领域已显示了令人鼓舞的前景。随着人类基因组计划的完成，人类表观基因组协会（humnanepigenomeconsortium,HEC）在2003年10月正式宣布开始实施人类表观基因组计划（humanepigenomeproiect,HEP），通过大规模检测人类基因组,基因组学研究进入一个新的阶段,也为解开生命奥秘及征服肿瘤等疾病带来了希望［16］。人类攻克癌症近在咫尺，但仍有很长的路要走，尚有不少难题有待在今后实践中予研究解决。让我们记住著名的系统科学家拉兹洛教授的话：“今天我们正目睹一场思维方式的转化：转向严谨精细而又整体的理论。这就是说：要构成拥有它们自己的性质和关系集成的集合体，按照同整体联系在一起的事实和事件来思考。”［17］。
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中图分类号：R273文献标识码：A
文章编号：1007-2349（2011）11-0085-03
非小细胞型肺癌（nonsmallcelllungcancer，简称NSCLC），是发生于肺部的常见癌症。根据病理学组织结构，可分为鳞癌、腺癌、大细胞癌等不同类型，约占肺癌总数的80~85%[1]。目前治疗以西医治疗为主，其中以手术治疗、放疗、化疗为主要治疗手段。中医作为辅助疗法不但可减轻放、化疗所致的毒副作用，而且有利于放、化疗顺利进行，在延长生存期等方面取得了较为满意的疗效。从总体治疗效果看，NSCLC的临床治疗已取得很大进展。本文就NSCLC的临床中西医治疗进展与展望作一综述。
1外科治疗
11一般手术治疗一般手术治疗仍然是目前治疗早期非小细胞肺癌最理想的方法。手术方法有肺叶切除、一侧全肺切除、袖式肺叶切除、气管隆凸再造、气管-肺动脉成形术等手术方法。同时需高度重视淋巴结清扫，只有通过系统肺门和纵隔淋巴结清扫才能达到完全切除和标准分期的目的。
12微创胸外科手术治疗目前，肺癌微创外科技术主要有3种手术方式，即视频辅助胸腔镜手术（video-assistedthoracoscopicsurgery，VATS）、机器人辅助胸腔镜手术（robot-assistedthoracoscopicsurgery，RATS）和保护胸壁肌肉的小切口开胸手术（muscle-sparingminithoracotomy，MSMT）。（1）VATS：目前中国多家胸外科中心已开展VATS肺癌切除术，在2008年第8次全国胸心血管外科学术会议上，华西医院刘伦旭介绍了更具有操作性、更加规范的“单向式胸腔镜肺叶切除术”，标志着中国VATS肺癌切除术的成熟。（2）RATS：近年，机器人已被引入外科手术中，这揭示了未来胸外科的发展趋势和方向[2]。2006年美国纽约纪念医院[3]报告了34例RATS肺叶切除的临床资料，无手术死亡，4例（12%）中转开胸，平均清除4组淋巴结，中位手术时间218min，中位胸腔引流时间3d，中位住院时间45d。（3）MSMT：随着器械外科技术的进步和小切口下手术操作技巧的提高，经MSMT可方便地施行与传统开胸手术相同的解剖性肺切除和系统淋巴结清扫，已能对绝大多数具备手术适应证的肺癌实施根治性切除，获得与传统后外侧切口肺癌切除术相同的治疗结果。
2化疗
目前化疗方案大致可分为两类：以铂类药物为基础的双药联合方案和不含铂类药物的方案。（1）以铂类药物为基础的双药联合方案是目前治疗NSCLC较常用的一种手段，药物的组合方式也有多种，铂类联合新药是目前治疗的首选方案[4]。对于有良好预后因素的晚期NSCLC患者采用联合顺铂与健泽、紫杉醇、异长春花碱化疗取得了令人满意的有效率；对于没有良好预后因素或老年患者，采用异长春花碱、健泽或紫杉醇单药治疗更为合适[5]。（2）不含铂类药物的方案药物主要是紫杉醇、多西他赛、泰素帝、吉西他滨等。目前最引人注目的方法是“TXT”（泰索帝）75mg/m2（毫克每平方米体表面积）单一药物治疗[6]。
3放疗
根据目前的研究，放疗可分为术前放疗、术中放疗和术后放疗3种方法。术前放疗的目的为清除手术区域以外的亚临床病变，减小肿瘤体积以及相邻组织之间的浸润，减少局部种植和转移的机会，以提高切除率和生存率。但是临床实践显示上述目的未能达到，并没有使患者受益，临床上已不常规采用[7]。术中放疗的目的是降低局部复发率，是近年发展的在手术残留部位以电子线进行的一次性大剂量（15gy～25gy）照射，手术伤口愈合后再行体外高能放疗。术后放射治疗可提高生存率，对于手术中癌肿组织未能全部切除或支气管断端残留癌浸润的病例可放置金属标记行放疗。
4分子靶向治疗
分子靶向治疗比传统的化疗具有更高的选择性，毒副作用小，是今后肿瘤治疗的新趋势[8]。目前临床应用的分子靶向治疗药物主要有以下3类：（1）作用于表皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶抑制剂是一种跨膜蛋白，为原癌基因EerB1（Her21）的表达物。这类药物包括易瑞沙和埃罗替尼等多种药物。（2）作用于血管生成的靶向药物是一种重组人源化抗血管内皮生长因子单克隆抗体，由培养在含庆大霉素培养基中的中国仓鼠卵巢哺乳细胞表达体系生产。这类药物主要有贝伐单抗等。（3）多靶点治疗药物是一种口服多靶点治疗药物，能选择性地抑制血管内皮生长因子依赖的肿瘤血管形成，而且对表皮生长因子受体也有一定抑制作用。这类药物有ZD6474等。
5免疫治疗
51主动免疫疗法主要有非特异性主动免疫疗法和特异性主动免疫疗法。（1）非特异性主动免疫疗法：目前主要应用具有免疫调节作用的刺激因子通过非特异性的作用激发机体的免疫系统，增强抗肿瘤的免疫应答。如卡介苗、短小棒状杆菌、左旋咪唑等，也可用细胞因子如白介素-2、白介素-4、干扰素、肿瘤坏死因子等。但由于肺癌的肿瘤抗原性不强，目前这种治疗难以取得明显效果。（2）特异性主动免疫疗法：随着对肿瘤免疫研究的深入，肿瘤疫苗和抗独特性抗体作为疫苗的发现使特异性主动免疫疗法成为可能[9]。某些抗独特性抗体与抗体上的抗原相关位点结合，能够模拟外来抗原，作为免疫治疗中替代性抗原。
52被动免疫疗法主要有过继免疫疗法和抗体疗法。（1）过继免疫疗法：目前肺癌的过继免疫疗法可以应用淋巴因子激活的杀伤细胞（LAK）输入体内或局部应用于癌性胸水，对延缓病情的发展有一定的效果，但单独应用治疗效果不佳。还可以应用肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL），通过基因修饰的TIL进行治疗。实践证明TIL的疗效比LAK要更好。（2）抗体疗法：目前抗体疗法正成为肺癌的另一研究热点，它已成为肺癌综合治疗的一部分。运用相应的单克隆抗体与异常表达的癌基因产物结合可以阻断癌细胞的异常信号传导通路，从而阻止癌症的发展[10]。
6介入治疗
目前介入治疗在NSCLC应用的方法主要有两种，即经支气管动脉灌注化疗和支气管栓塞治疗。经支气管动脉灌注化疗可有效提高肿瘤局部药物浓度，提高抗癌药物的解毒作用，同时又可以减少或阻断肿瘤的血供，使其缩小、坏死。支气管栓塞治疗可通过介入放支架解除肿瘤引起的中心气道狭窄或阻塞，对继发于肺癌的上腔静脉综合征患者血管内置人支架是较好的方法。
7基因治疗
基因治疗在该病所应用的方法主要有[11]诱导特异性免疫的基因治疗和直接作用的基因治疗两种。诱导特异性免疫的基因治疗即输送生物活性基因来改变癌细胞的局部免疫环境，增加癌细胞的免疫原性和T细胞的反应性，改善抗原提呈和提供缺失的旁分泌。由于免疫性诱导是遗传性系统性的，同时靶子来源于肿瘤抗原，因此所诱导的免疫性具有潜在发现和杀死没有经过基因修改的肿瘤细胞。这一特点可能对以远处转移为主要问题的肺癌具有重要意义。直接作用的基因治疗主要有抑癌基因的治疗、药敏感性基因治疗和反义cDNA和寡核苷酸技术3种方法。
8中医药治疗
中医学侧重辨证施治，从整体调节入手，目前中医药在治疗肺癌中，特别是在NSCLC的防治方面主要有以下作用：（1）防治手术、放疗、化疗副反应；（2）配合手术、放疗、化疗减毒增效；（3）在抗非小细胞肺癌复发和转移的综合治疗中起很重要的作用；（4）不能手术、放疗，不宜再化疗的肺癌患者，中医起主导作用，即改善症状、提高生存质量、延长生存期[12]。
81病因病机中医学认为，肺癌属“肺积”“痞癖”“咳嗽”“咯血”“胸痛”等范畴，病位在肺。学者们对其病因病机虽然有不同的认识，但无外乎正气虚损和邪毒内积两个方面，本病病变部位在肺，与脾、肾有关，病理因素主要为气滞、痰浊、瘀血、热毒，病理性质为本虚标实，虚实错杂。在治疗过程中，扶正培本为其关键。
刘丽坤等[13]认为，肺癌的基本病机为正虚邪实。正虚是肺癌发生的基础，是复发、转移的关键，其中肺阴亏虚贯穿疾病的始终，痰瘀毒结是肺癌的主要病理表现。刘嘉湘认为肺癌总属本虚标实，由于正气先伤，邪气得以乘虚而入，聚积于肺，导致气滞血瘀、聚液为痰、痰瘀交阻而渐成肿块。高萍等认为放化疗副反应是毒邪内侵，损害肝脾肾等脏腑功能，耗伤机体气血津液，导致气血阴阳的失调与缺失。
82辨证分型中医将肺癌看作是全身性疾病的一个局部表现，主要根据症状和体征对肺癌进行辨证分型，治疗上强调全面调整人体机能。目前主要依据阴阳盛衰、气血的虚实、脏腑病机以及邪毒性质进行归类分型。这些证型基本反映了肺癌病情发展不同阶段的一些规律。刘嘉湘对405例非小细胞肺癌病例进行研究，其中阴虚和气阴两虚型占肺癌的726%，指出肺癌的病机特点以阴虚和气阴两虚为主。杨国旺等将肺癌划分为气虚、阴虚、阳虚、血虚、痰湿、血瘀、毒热7个基本证型。李忠等研究发现以气阴两虚及痰瘀互阻证型最为常见，其他依次为脾虚痰湿、肺脾气虚、气虚血瘀、痰湿阻滞等。孙士玲分为肺脾气虚、肺，胃阴虚、肺热痰湿、气滞血瘀型。
83中成药中医药作为一个辅助疗法，在非小细胞肺癌的治疗中起到了很大的作用。随着中药制剂现代化研究，研制成了很多中成药，有很好的临床疗效。目前临床上使用的口服中成药有固本消瘤胶囊、乾坤胶囊、平消胶囊、抗瘤冲剂、仙露冲剂、中成药鹤蟾片、参一胶囊等。治疗NSCLC的中药静脉制剂主要有康莱特注射液、参麦注射液、丹参注射液、艾迪注射液、华蟾素、榄香烯、岩舒注射液等。
9回顾与展望
非小细胞肺癌的手术、放疗、化疗和生物治疗等在临床治疗上已经取得了很大的进步，但是治疗效果仍不能令人满意。中医药作为一个补充治疗手段和方法正起到越来越重要的作用。中医的整体观从大局出发，提倡提高机体正气抗邪，防止病情进展，正弥补了西医重局部的不足。中医药治疗肺癌的疗效以病灶稳定率较高、生存期较长、改善生活质量较好为主要特点，在抗复发转移，减负增效方面有一定的优势，对于已无放化疗机会晚期肺癌患者，中医药治疗是缓解疾苦的主要手段。但是中医治疗在很多方面还不完善，比如辨证分型缺乏统一的认识，临床应用个案报道数量较多，缺乏大样本、多因素的观察，循证医学证据并不充分等。
笔者认为目前西医治疗一方面微创手术研究是未来外科手术的发展方向，另一方面靶向治疗、免疫治疗和基因治疗都是肺癌多学科治疗中新的研究和应用热点，日益受到重视，是以后发展的方向。要注意提高药物疗效，降低毒副作用，延长患者（尤其是晚期肺癌患者）的生存期。中医治疗应从扶正祛邪，整体调节入手，应特别重视调补肺脏功能兼顾调整五脏功能。具体来说，整体方面要调理饮食，注意饮食平衡；调理药物，注意药物之间的平衡，勿太过不及；调理五脏功能，勿偏盛偏衰。局部方面要注意调整肺脏本身的功能和调整脾胃功能。中医认为“人以胃气为本”、“脾胃为后天之本，为气血生化之源”，脾胃功能好坏对疾病的预防和治疗都有很重要的作用，尤其在肺癌的防治中更是具有重要价值。未来该病的治疗必将走上一条中西医互补的道路，因而希望能够多学科配合、大胆摸索、反复实践，更好的发挥中西医结合在NSCLC预防治疗中的特色和优势，从而对人类防治NSCLC整体水平的提高起到积极地推动作用。
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中图分类号：G642.41 文献标志码：A 文章编号：1674-9324（2015）03-0119-02
基因工程又称为基因拼接或者DNA重组技术，是将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序。1972年美国人Berg在基因工程基础研究方面做出了突出贡献，被公认为“基因工程之父”。1973年美国人Cohen等用核酸限制性内切酶EcoRI，首次基因重组成功。近些年来，基因工程的新概念、新理论及新技术不断涌现，内容也在不断丰富与充实，已广泛应用于生命科学的各个领域[1，2]。21世纪以来，基因组学已进入功能基因组学时代，对基因功能的研究是生物技术发展的新方向，体现了基因工程的重要价值所在。基因工程学作为当代生命科学研究领域最具生命力、最引人关注的前沿学科之一，已经发展成为现代分子生物学、技术学的核心内容，其课程质量的好坏直接关系学生的专业素质和创新能力的培养。作者所在学院（浙江海洋学院海洋科学与技术学院）于2007年新增了生物技术专业，同时开设了基因工程课程。为了不断提高该课程的教学水平，笔者结合这几年的教学经验以及兄弟院校相关课程的授课经验，努力充实教学内容，不断更新教学手段，对基因工程课程的教学体系进行了探索式改革。
一、教学内容
1.不断更新教学内容，突出实用性。基因工程理论作为一种专业性很强的课程，需在学生有一定生物学知识的基础上教学。在浙江海洋学院本课程于大三下学期开课，在此之前学生已修完细胞生物学、分子生物学、遗传学等生物学基础课程，具备了较完整的理论知识体系，在此基础上开展教学，有利于学生对知识的理解和掌握。基因工程作为一种技术性很强的课程，与上述生物学基础课程关系密切，同时与酶工程、蛋白质工程、细胞工程等学科紧密联系，存在一定的内容重复。在教学过程中，对于此类重复，或一笔带过，点到为主，或采用实例对重要知识加以巩固，尽量避免重复，突出课程特色。教材是提高教学质量的重要环节，浙江海洋学院第一次即2010年选用的《基因工程》教材由高等教育出版社出版，孙明教授主编。该教材内容全面翔实、章节清晰，对基因工程的原理、策略和技术方法均有系统介绍，具有很强的理论性和前瞻性。但是其内容较多，很多内容对于二本院校本科生来讲过于深奥、难以理解，学生也反映该教材较难，建议选其他较易理解的教材。结合该院校是二本院校的实际，笔者从2011年开始使用袁鹜洲主编，化学工业出版社出版的《基因工程》，属普通高等教育规划教材。本教材为国家精品课程教材，主要介绍了基因工程的基本概念、基本原理、常用基因工程操作技术以及基因工程与功能基因组学相结合的技术应用进展。主要内容包括三大块。一是基因工程的基本原理与基本技术，包括工具酶和克隆载体。表达载体及常用的基因表达系统，目的基因获取、制备、扩增、导入与鉴定的各种方法。二是基因工程在功能基因组学研究中的应用，包括基因表达谱的研究技术，全基因组化学诱变、转座子饱和诱变的技术，基因敲除与基因敲减的技术，GAL4/UAS过表达系统，酵母双杂交及免疫共沉淀等蛋白质相互作用研究的技术等。三是基因工程在工农业生产中的应用，包括转基因植物、转基因动物的制备与应用，基因治疗的原理与策略以及基因工程药物的研制与现状等。该教材内容清晰易懂，实例举证充分，且涉及基因工程在实际生产中的应用，在一定程度上可以提高学生的学习兴趣。使用该教材3年来，目前感觉学生反映较好，适合该校学生使用。
2.引领学生了解前沿动态。基因工程作为一门前沿学科，发展速度快，内容日新月异。我们常用教材多侧重原理、基础等理论知识，且更新速度始终落后于基因工程技术本身的发展速度。现代学生思维活跃，求知欲强。为了充分满足学生的求知欲和好奇心，在基因工程教学过程中，尽可能地添加一些新成果、新理论和新技术[3]，如：生物能源，基因工程疫苗的开发，基因治疗等，并结合自己在国外实验室所学向同学们展示最新技术与相关研究进展。基因工程的新技术多发表于Science、Nature、Cell等顶尖杂志，在教学过程中，对于发表的经典新成果，尝试让学生自己阅读、分段翻译、小组讨论，增加对新知识的了解[3]。一些重要的生命科学论坛，如：生物谷、丁香园、小木虫等是生命科学领域研究人员交流学习的地方，而知识的碰撞最容易产生科学的火花。因此，鼓励学生浏览这些论坛，并参与讨论，增强学习兴趣。另外，也鼓励他们加入相关的QQ群，比如转基因群、生物信息群，增加同业交流，为自己拓宽理论知识和解决实际技术问题，同时也为今后从事的相关工作打下坚实基础。
二、教学手段和教学方法多元化
不像动物学、植物学可以直观地看到实物，基因工程内容抽象，多涉及细胞、分子等微观内容，且高新技术多，操作流程长，如果仅仅采用文字和语言表述，难以讲授明白，学生学起来也比较晦涩难懂[4]。因此，需要运用多种教学方法，使概念、原理讲得通俗易懂，学生理解起来就更容易。
1.多媒体教学的应用。目前，大部分高校已广泛采用多媒体教学。在基因工程多媒体教学过程中，改变原来单纯的文字、图片等内容，不断尝试加入一些声音、录像、动画等信息，使课堂图文并茂、有声有色、栩栩如生，便于学生理解并强化记忆。如在讲解“PCR反应”一节中，自己录取了PCR的准备、操作以及电泳检测等全套过程，老师讲得省心，同学们听得舒心，极大提高了基因工程课程的教学效果。
2.小组讨论式教学。有价值的讨论是促进学生开动脑筋、举一反三、加深认识的有效手段。在遇到抽象内容时，讲解完毕后，鼓励学生分组讨论，并选出一名组长上讲台以PPT的形式汇报本小组的学习心得，组长实行轮换制。下面的同学给汇报的小组分别从以下几方面打分：汇报PPT的表现，制作PPT的质量，所讲内容的条理性、创新性以及讲解能力。通过此手段，极大调动了学生的学习积极性。例如，可引导学生讨论以下专题：①转基因动物；②中国的转基因水稻；③基因工程产品的安全性；④基因治疗。
三、改革实验教学、科研项目与课程教学相结合
本校基因工程实验是在大三结束后的暑假短学期开展的，共16学时，这时学生已上完基因工程理论课，具备了实验操作的相关理论知识。实验内容至关重要，是理论知识的综合运用。那么如何选择实验内容呢？这一点比较关键。授课教师多具有博士学位，承担着较高水平的科学研究工作。在基因工程教学过程中，尝试将实验内容和教师的科研项目相结合，让学生自主参与到科研项目的研究中。学生可根据教师的科研项目自主确定实验课程内容，从实验内容的选择，到实验方案的设计、试剂的购置、实验步骤的进行等都由学生自主完成，老师在此过程中起指导作用。笔者将课题“曼氏无针乌贼微卫星富集文库的构建”分解成几个小实验，包括PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳、限制性内切酶酶切反应、载体连接、感受态细胞的制备及转化、蓝白斑筛选与鉴定、测序、序列分析和引物设计等，指导学生进行整个流程实验，使其知识更具有系统性、完整性。此外，还可鼓励学生申报省级或校级的大学生创新项目，由笔者指导的“转基因绿色荧光观赏鱼开发技术探索”以及“青鱼β-actin基因的启动子功能初步检验”分别获得省级可喜奖项，这个实验培养了学生的创新能力及今后独立从事科研的能力。
四、试探采用双语教学
现代高素质专业人才不仅要具备高水平的专业知识，还应具备高水平的专业外语阅读与写作能力。为适应学科发展趋势，并扩充学生的英语专业词汇，培养英语思维模式，在基因工程教学过程汇总尝试进行双语教学[5]。在教学上，以中文课件为主，主要的专业词汇用英文标注，时而用英文讲解，尽量创造双语教学环境。并且鼓励学生借阅相关的英文教材，例如，在国际上使用广泛，权威性和时代感强的英文教材《Principles of gene manipulation and genomics》（7th ed）作为教学参考书。
简而言之，经过几年的努力工作，浙江海洋学院在基因工程课程的教学内容方面进行了优化，改进了教学方法与手段，培养了实验设计能力和创新意识，拓展了他们的知识面，取得了不错的效果。然而，课程教学改革是一项系统工程，目前还处于探索和实践阶段，必须坚持不断地探索、实践、总结，最好建立一支教学团队，希望把基因工程课程教学改革工作开展得更有效果，为国家输送更多高素质的专业人才。
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尤为业内瞩目的是，汪道文教授在国内率先建立和开展了心脑血管病新危险因素的检测临床研究，并率先开展了疾病的基因诊断和以基因诊断与分型为基础的个体化诊断医疗。他和他的团队先后开展基因诊断项目600余项，为临床解决了大量疑难问题；在心律失常、肥厚型心肌病、婴儿黄疸和大血管疾病等的基因诊断方面走在了国际前列。
阳春三月，在第六届国际心血管病靶向治疗论坛（CTT 2015）召开期间，本刊记者就“疾病的基因诊断和基因诊断与分型”以及基于此的“疾病个体化诊断医疗”等话题，对汪道文教授作了深入采访。
“量体裁衣”，
基因诊断助推个体化医疗
采访一开始，汪道文教授首先诠释说：“随着人类基因组学、药物基因组学及分子生物学研究的不断深入和发展，人们对疾病多成因、异质性及个体化差异的特点有了更加全面的认识。个体化治疗已成为临床治疗的发展方向和最有效的手段；个体化医疗的理念也被推至前台，已被越来越多的科研工作者和临床医生所认识和接受。”
汪道文教授进一步解释说，所谓个体化医疗（Personalized Medicine， Individualized Medicine），即认定病人对不同药物和治疗反应的遗传学变异，针对致病分子靶向治疗； 此外，还发展和利用以遗传和分子机制的诊断，以更好地预测对靶向治疗的反应。
他认为：“基于基因诊断技术的个体化医疗之根本，在于根据病人个体的遗传结构差异，实现‘量体裁衣’式的个体化用药方式，而这将成为未来理想的治病新模式。但从临床上看，早期预测，个体化的治疗并非像简单的遗传变异分析那样简单。个体化医疗的一个重点就是强调提前干预。如果通过基因测序发现有糖尿病或者心血管疾病发病风险，就可以在饮食方面做一些先行调整，改善营养平衡，延缓降低发病几率和时间；可以在人们尚无任何症状的情况下，通过基因检测预测1年或5年以后患有某些疾病的风险有多大，比如某好莱坞电影明星有乳腺癌家族史，她通过基因检测发现带有乳腺癌遗传突变基因，于是就做预防性切除术，降低了患癌风险。这就是典型的在发病以前进行积极干预的事例。因此随着个体化医疗的逐步发展，针对个体化的检查和监测将成为现实。而这将对心血管疾病的早期检测和干预提供极大的帮助，对心血管疾病的早期发现、早期诊断治疗及预后的改善，产生积极影响。”
汪道文教授继续诠释说，个体化医疗中所谓的“量体裁衣”，是指根据服务对象在生物分子水平的特征，制定有针对性的保健措施和治疗方案。在这方面，药理遗传学的兴起极大地推动了个体化医疗的发展；特别是在心血管领域，药理遗传学已经成为一门热门的研究方向，最有代表性的就是华法林的个体化用药及抗血小板药的个体化选择。近年来，随着药物基因组学的不断深入，依赖于药理遗传学的结果而建立起来的华法林维持剂量应用模型，不断地在尝试应用于临床。
据了解，在最近的AHA会议上，EU-PACT研究发现按基因型确定华法林剂量，优于使用临床标准剂量（N Engl J Med. 2013 Nov 19）。对此汪道文教授谈到：“确实，我们同济医院心血管实验室已完成了近1000例患者基因分型指导华法林剂量的调整。我们的临床实践证明，通过基因分型，按照药理遗传学模型能非常准确有效地指导临床华法林应用，可大大减少INR的检查和降低由于用量问题带来的风险。因此我们相信，随着研究的继续深入和药物治疗模式的不断改进，临床上采用以药物遗传学为基础实行华法林的个体化治疗时代已经来临！”
“4P医学”将在未来
真正得以实现
采访前记者获悉，学术界曾有一种看法：目前开展的人类基因测序产生了海量数据，这至少带来了两个问题，一是存储所占空间太大，传输、计算也会变得很慢；二是如何筛选有用数据的难度也进一步增大。那么，在心血管疾病的基因诊疗方面，如何有效用好海量数据、提高诊断治疗效果？
对此问题，汪道文教授介绍说：“对于高通量测序带来的巨大数据量，我们的做法是，引进专业服务器对数据进行存储和分析。这一方面缓解了海量数据带来的存储压力，另一方面经数据处理的本地化相比数据上传至云端，原始测序数据就能得到更快、更全面的分析，大大提高了工作效率。”
汪道文教授也认为，高通量测序产生的海量数据，的确对数据的分析和采用提出了更高的要求，而从庞杂的突变（或多态性位点）中准确识别致病突变，既是高通量测序技术应用于临床检测的基本要求，同时也是难点之一。针对这些问题汪道文教授解释说：“在数据分析过程中，我们的科研技术人员会经过数据的筛选，数据库和文献库的比对，并结合临床，最终判断一个突变是不是致病突变。总的来说，致病突变的识别，一部分来自于已有的基础研究，我们的研究技术人员必须掌握前沿的科研成果，并及时更新我们已有的突变数据库，以准确识别致病突变；对于一些我们认为有价值但还没有研究基础的可疑致病突变，我们也会深入地开展功能相关研究，将我们自己的研究成果运用于临床检测。另外，表型和突变联系紧密的家系，也能为我们提供报道致病突变的依据。只有充分掌握疾病的相关遗传学研究成果，并积极开展表型-基因型关系的研究，建立严格的致病突变识别流程，才能准确并高效地将高通量测序技术应用到临床诊疗，否则，庞杂的测序数据对病人来说，无异于一部‘天书’，而为病人准确地解读这部‘天书’，则是相关从业人员的责任。”
在采访中汪道文教授强调：“需要指出的是，现在人类的基因组测序已经完成，但是具体单个基因或者某一段基因与疾病的关联性的研究，还远远没有达到预期目标，而这也是全世界科研工作者正在努力的方向；特别是在国内，基因诊断才刚刚起步，个体化医疗的路程还很长，但我们坚信，随着生物医学技术的飞速发展，我们对于许多疾病的分子机制会了解得更加深刻。个体化医疗将会在基因分子层面早期预测疾病，从而降低发病风险，延缓发病时间，最终改善患者预后。另一方面，个体化医疗的发展与临床息息相关，这需要不断加强对临床医生的教育和培训。以美国为例，临床医生的培训对于基础医学的要求是比较高的，许多人进入临床工作以后，仍然在分子生物学、生物化学等方面有很好的造诣。这一点对于中国来说还比较欠缺，这也是阻碍我们临床医生水平提高的障碍之一。针对这些问题，我们曾经举办过‘全国基因诊断与基因分型临床应用学习班’，其目的就是希望我们能通过举办学习班，将基因诊断及个体化医疗的概念灌输到每一个人的脑海中，将分子医学的种子播散到每一个人的心田；同时通过培训，也希望他们将基因诊断及个体化医疗的意识带回到本科室、本医院、本地区，以此在全国范围内逐步普及基因诊断及个体化医疗的相关知识。”
此前记者了解到，随着抗血小板药物的广泛使用，人们发现并不是所有规则用药的患者都能获得一致的临床疗效。近年的研究表明，长期应用抗血小板药物，导致约50%的患者疗效降低或无效。汪道文教授曾长期进行基因多态与抗血小板的治疗研究，那么，这项研究将会给抗血小板临床治疗带来哪些影响？
对此问题，汪道文教授谈到：“根据血小板功能和个体化基因型采用个体化抗血小板策略，仍然是心血管领域未来的发展方向。更广泛地开展个体化抗血小板治疗，以带来心血管预后的改善，仍然需要更多的临床试验结果支持。同时，随着分子生物学技术的发展，利用全基因组关联研究策略进行药物代谢酶相关基因进行变异筛查，结合临床多中心、随机、双盲、对照试验，相信在不久的将来，我们能够为每一位需要抗血小板治疗的患者进行分子分型，解读人类的基因‘天书’，并为其贴上一个‘基因标签’，这无疑会对个体化诊疗以及疗效评估带来益处。这方面，仍然需要加强对医生的继续教育，同时根据中国人的特殊基因型和基因变异频率，制定适宜中国人群的个体化用药方案。”
“总之，个体化医学将是医学发展的趋势。我们期待在不久的将来，‘4P医学’将真正实现：预测（Predictive）、预防（Preventive）、个体化（Personalized）、参与（Participatory）。”汪道文教授满怀信心地说。
我们的成就主要来自于勤奋
医学界的很多人都明白，从现实的角度而言，医学基础研究很多时候是“得不偿失”的，但据记者了解，在汪道文教授的带领下，华中科技大学同济医学院附属同济医院心血管内科，却把基础研究放在了科研的重要位置，并取得了实验室满负荷工作，取得了平均每年发表SCI论文15篇至20篇的重要成就。作为教育部重点学科和国家卫生计生委临床重点专科，该院的心血管内科在医院发展战略基础上，努力加强学科内涵建设，矢志成为服务全省、辐射全国的强势学科。
那么，他们这个科室开展基础研究的情况，又有哪些经验可以与大家分享？问及这一话题，汪道文教授首先介绍说，华中科技大学同济医学院附属同济医院心血管内科的基础研究，主要以心脑血管病领域内源性保护机制为重点，特别在组织型激肽释放酶（TK）、一氧化氮合酶（eNOS）心血管保护和表氧化酶-EETs代谢方面有重要突破。
汪道文教授认为：“我们之所以能取得这些成就，主要还应归功于勤奋。我们实验室的满负荷工作是基于24小时工作时间的基础上，其研究方向由不同的实验小组来完成；此外，我们还有一个较好的学术研究梯队，形成了以老带新、传帮带的氛围。每位研究生到实验室做实验，首先会被告知全年无节假日，要有充分吃苦耐劳的心理准备。他们会被分到不同的小组展开实验研究，实验室会定期开展学习，汇报研究进展，讨论下一步的实验开展计划，并邀请全国甚至全世界该领域的顶尖专家交流学习最新进展，为实验工作的有序进行打下了坚实的基础。”
在取得这些成就的同时，他们还不遗余力地把学术交流、推广与规范培训当成另一项重要使命。他们在连续6年成功主办“同济心血管疾病高峰论坛”的基础上，2014年10月10日至12日，又成功主办了“第七届同济心血管疾病高峰论坛”暨“全国基因诊断与基因分型临床应用学习班”。对此汪道文教授介绍说：“去年的论坛邀请了全国心血管领域及基础领域20多名专家授课，吸引了湖北省及周边地区40多个县市的医务工作人员500余人前来参加。本次论坛分为基础论坛、电生理三维演示训练会、临床诊疗进展和临床病例讨论4个部分。内容涉及介入心脏病学、心脏起搏与电生理学、心力衰竭、高血压及心脑血管疾病的基础研究，尤其突出了具有同济医院特点的大血管疾病诊治新技术；病例讨论是本次会议的另一特点，吸引了广大基层医生的广泛参与和热情讨论；其最大的亮点是新增了急危重症专场讨论部分，有极大的临床实用性。”
【关键词】 小干扰RNA; 结直肠癌; FAK; 细胞增殖; 细胞运动
[Abstract] AIM: To investigate the effect of siRNA targeting FAK gene on proliferation and motility of colorectal cancer. METHODS: Recombinant plasmids that produced siRNAs targeting FAK were designed and cloned， then transfected into Caco2 cells. The changes of FAK expression levels were examined by RTPCR and immunocytochemistry. The effects of FAK gene knockdown on apoptotic morphological changes， proliferation， and motility were investigated. RESULTS: Recombinant plasmids targeting FAK were successfully constructed， FAK mRNA and protein level was silenced in Caco2 cells significantly. The inhibition of mRNA level was achieved maximal at 48 h post transfection with time dependent. The ability of proliferation and motility of Caco2 cells were significantly decreased. CONCLUSION: Plasmidmediated FAK siRNA could inhibit FAK gene expression. The proliferation， motility and apoptosis were inhibited effectively， which suggested that FAK expression is closely associated with the proliferation， motility and apoptosis， etc. The results may be used as the reference for gene therapy of colorectal cancer.
[Keywords]small interfering RNA; colorectal cancer; FAK; cell proliferation; cell motility
近年来以黏附相关因子为靶点的治疗成为基因治疗研究的新策略[1]， 黏着斑激酶(focal adhesion kinase， FAK)是近年来发现的细胞黏附介导的信号通路的重要因子， 作为胞内信号蛋白酪氨酸激酶， 于1992年被独立鉴定为Src癌基因的底物。FAK的相对分子质量(Mr)为125 000， 定位于人染色体8q24， 与cmyc基因座接近， 此基因座在人癌细胞中往往被激活而强化[2]。FAK作为信号转导的关键分子， 可传递由胞外到胞内的多种信号， 其在结肠癌中表达升高而在正常组织细胞中表达呈弱阳性的特点开始引起研究人员的关注[3]。有研究显示， FAK基因在结直肠癌组织中表达升高[4]， 并与癌细胞增殖、 侵袭转移密切相关， 但作用机制还不明确。本实验将靶向FAK基因的siRNA表达载体导入Caco2细胞， 探索FAK siRNA对结直肠癌细胞增殖和迁移的影响并初步探讨其作用机制， 为结直肠癌基因治疗积累实验资料。
1 材料和方法
1.1 材料 人结直肠癌细胞株Caco2购于美国ATCC。重组质粒pU6H1GFP/FAKsiRNA为本实验室设计、 百奥生物技术有限公司(南通)构建， 大小为5.5 kb， 经测序正确。限制性内切酶Hind Ⅲ购自NEB公司。脂质体Lipofectamine 2000、 TRIzol试剂均为美国Invitrogen公司产品。RPMI1640培养基购自美国Gibco公司。胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司。四甲基偶氮唑蓝(MTT)购自美国Amresco公司。RT007 AMV反转录酶购自杭州博日科技有限公司。FAK、 GAPDH引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成。针对FAK的单克隆抗体(mAb)购自Santa Cruz公司。SP免疫组化试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司。Hoechst 33258购自南京凯基基因有限公司。其他试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 siRNA的设计及构建 利用Ambion siRNA在线软件设计了2条针对FAK的siRNA: siFAK1: 5′GGGCAGACGAGACCACACTGA3′; siFAK2: 5′GAAATGGAAGAAGATCAGCGCT3′; 错义对照序列siRNASCR: 5′GCATCTAAGGTATCGTTGTGGCTC3′。经Blast比对证实与人其它基因无同源性后构建合成siRNA表达载体， 双启动子U6和H1之间插入人FAK及错义siRNA靶序列。
1.2.2 细胞转染 于6孔培养板， 将Caco2细胞接种于无抗生素、 含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液， 细胞接种密度: 2×105/孔， 饱和湿度培养24 h。参照Lipofectamine 2000说明书进行转染优化， 转染后6 h更换完全培养基。实验分为: 正常对照组(未转染的Caco2)、 错义siRNASCR组(非特异性siRNA转染)、 干扰组siFAK1、 siFAK2。
1.2.3 GFP表达检测及转染效率评价 转染后细胞于激发波长为488 nm的荧光倒置显微镜下检测GFP的表达情况。以放大100倍的视野为标准， 计5个视野表达绿色荧光的细胞数和总细胞数， 求GFP表达率: GFP表达率=发绿色荧光细胞数/细胞总数×100%。
1.2.4 细胞凋亡形态学检测 取对数生长期细胞以2×105/孔接种于铺有无菌盖玻片的6孔板中， 每组爬片4张， 转染48 h后弃培养液， PBS洗3次， 40 g/L多聚甲醛4℃固定15 min， PBS洗3次， 吸净液体， 每孔加入200 μL Hoeschst 33258工作液， 避光孵育10 min， PBS漂洗封片， 荧光显微镜下随机选取高倍视野进行拍照， 激发光波长为365 nm。
1.2.5 RTPCR检测 收集转染后24、 48、 72、 96 h细胞， 各组细胞总RNA按TRIzol试剂说明书提取。将总RNA(0.5 μg)行10 μL反转录体系。取cDNA再进行25 μL PCR反应。PCR循环参数为: 95℃预变性2 min; 94℃变性40 s， 46℃退火40 s， 72℃延伸1 min， 共28个循环(GAPDH: 18个循环)， 于72℃延伸10 min。FAK上游引物: 5′GCGTCTAATCCGACAGCA3′， 下游引物: 5′GCCGACTTCCTTCACCAT3′， 扩增产物为445 bp; 内参GAPDH上游引物: 5′AATCCCATCACCATCTTCCA3′， 下游引物: 5′CCTGCTTCACCACCTTCTTG3′， 扩增产物为580 bp。各取5 μL扩增产物， 经15 g/L琼脂糖凝胶电泳， 凝胶成像仪下观察结果及照相， BandScan 5.0进行条带分析， 检测各组FAK与GAPDH的灰度比值表示FAK mRNA表达水平变化， 比值越高说明目的基因表达越高。
1.2.6 细胞增殖检测 调整细胞密度为6 000个/孔， 接种至96孔板， 设Blank组(只加完全RPMI1640培养液)、 siRNASCR组、 正常对照组、 干扰组(siFAK1、 siFAK2)， 每组每个时间点设6个复孔。培养24 h后弃上清， 进行转染(脂质体: 0.5 μL， DNA: 0.2 μg)。于孵箱中继续培养24、 48、 72、 96 h后每孔加入MTT(1 g/L)15 L， 37℃、 50 mL/L CO2避光孵育5 h， 再加入100 μL DMSO振荡10 min， 酶标仪562 nm处测定各孔A值。生长抑制率=(1-处理组平均A值)/正常对照组平均A值×100%。
1.2.7 细胞迁移检测 于6孔板内按上述方法进行转染， 培养24 h后用外接真空泵的1 mL移液枪头(直径1.5 mm)垂直于6孔板板底分别打孔， PBS清洗2次， 更换完全培养液。分组同1.2.2， 40倍倒置显微镜下照相。于转染后48、 72、 96、 120 h继续照相， Gene Tools软件测定每孔各时间点面积。迁移率=(1-该时间点损伤面积)/原始损伤面积×100%。
1.2.8 免疫细胞化学检测 将细胞接种于铺有无菌盖玻片的6孔板中(1.5×105/孔)， 每组爬片4张。设阴性对照组(PBS代替一抗)、 siRNASCR组、 正常对照组、 siFAK1和siFAK2共5组。转染48 h后取盖玻片用SP试剂盒检测， FAK mAb稀释度为1∶300， 避光条件下， DAB显色， 三蒸水冲洗停显， 梯度酒精脱水， 二甲苯透明， 取出盖玻片置于载玻片上， 胞质出现棕褐色为阳性染色。中性树胶封片后， 每组随机选取10个高倍视野(×200)， 进行图像采集。
1.2.9 统计学分析 数据以x±s表示， 采用SPSS15.0软件进行方差分析。P
2 结果
2.1 重组质粒pU6H1GFP酶切鉴定 用Omega无内毒素质粒小提试剂盒扩增并纯化质粒， 经Hind Ⅲ 酶切鉴定， 可见质粒可被切割成大约5.5 kb的线性片段， 结果完全正确(图1)。
2.2 转染效率 经优化的脂质体条件转染后， GFP表达率为(44.59±2.71)%。
2.3 细胞凋亡的形态学观察 经Hoechst 33258染色可见正常对照组细胞染色质为弥漫均匀的低强度荧光， 无明显凋亡特征(图2A); 经siFAK1和siFAK2组转染细胞48 h后， 细胞表现出典型的凋亡形态学变化， 胞核呈浓染致密的固缩形态、 断裂成块、 呈颗粒状亮蓝色荧光， 且有少量凋亡小体出现(图2D、 E中箭头所示)。脂质体组及siRNASCR组均没有出现明显的凋亡形态学改变(图2B、 C)。因此可得出脂质体试剂及pU6H1GFP载体对转染无明显影响， 排除假阳性的干扰。
2.4 FAK mRNA表达变化 转染Caco2细胞于24、 48、 72、 96 h后检测siRNA敲低FAK mRNA水平表达的时间效应关系， 并确定敲低效果最好的1条序列。RTPCR结果显示， 各组内相应内参GAPDH的条带基本一致， siFAK1和siFAK2组FAK mRNA水平低于正常组和siRNASCR组， 且敲低效应在转染后24～48 h范围内呈时间依赖性降低， 至48 h降到最低(P
2.5 细胞增殖状况 MTT法检测表明， siFAK1和siFAK2组细胞增殖抑制率明显增加(图4)。与正常对照组相比， siFAK1和siFAK2对细胞增殖的抑制率在转染后24～72 h均有统计学意义(P
2.6 细胞迁移状况 与正常组相比， 特异性siFAK1、 siFAK2组使Caco2细胞的迁移率明显降低(P
2.7 FAK蛋白表达变化 免疫细胞化学方法检测结果显示， 正常组FAK表达多位于胞质， 呈棕褐色， 强阳性表达， 而siFAK1、 siFAK2组细胞中FAK蛋白的表达明显减弱(图6)。ImagePro Plus 6.0图像分析各组的A值， 转染后48 h siRNASCR组、 正常对照组、 siFAK1及siFAK2光密度分析结果分别为0.223±0.006、 0.254±0.002、 0.059±0.006、 0.079±0.008。可见转染后48 h两个干扰组的蛋白表达明显被抑制(P
3 讨论
FAK作为Src癌基因的底物， 位于整合素富集的黏着斑处， 与多种信号分子相互作用， 介导多种细胞表面受体激活及信号传输来调控细胞骨架组建、 细胞增殖、 凋亡及存活、 细胞转移及入侵等， 最终参与肿瘤的发生。有研究表明， 在正常结直肠上皮细胞中FAK表达呈弱阳性或阴性[5]， 这与维持上皮细胞的生理功能是不可缺少的; 而在结直肠癌相关的细胞中FAK表达明显升高， 说明其表达上调可能是结直肠癌具有恶性表型的早期事件。因此， FAK作为肿瘤发生进程相关的关键分子可能成为肿瘤治疗的靶点， 而抑制FAK的表达则有望成为肿瘤基因治疗的新热点。针对FAK基因的反义寡核苷酸治疗结直肠癌的研究已有报道[6]。RNAi是近年来快速发展的一种高效的基因沉默技术， 并作为一种关键技术应用于抗肿瘤、 基因功能研究[7]。
本实验以Caco2细胞为研究对象， 采用针对FAK mRNA的特异性siRNA重组表达质粒进行转染。RTPCR显示， 所设计的两个siFAK重组质粒均能使其mRNA水平下降， 其中以siFAK1干扰效果更强， 在转染后48 h敲低效果最明显， 说明siRNA对FAK的抑制作用可能有时相性。而错义组则没有上述作用， 从而另一方面证明RNA干扰的特异性。同时免疫细胞化学检测结果也显示转染后48 h siFAK1对细胞FAK蛋白抑制更明显。
细胞增殖和迁移在多种恶性肿瘤的病理生理过程中起重要作用。有研究表明[8]， 活化的FAKRASMAPK是促进细胞迁移和增殖的重要信号通路。本研究中， 细胞增殖及迁移实验表明， 靶向FAK基因干扰Caco2细胞后， 细胞贴壁能力降低， 变圆易脱落， 细胞的增殖及迁移明显受抑， 因此我们推测FAK基因表达受抑可使FAKRASMAPK信号通路受阻， 最终导致细胞增殖及迁移能力降低， 提示FAK基因可能是结直肠癌肿瘤治疗的一个新靶点。相反siRNASCR组对细胞的增殖及迁移无明显影响， 因此可以断定质粒载体pU6H1GFP可以作为安全有效的基因载体。近年来有关研究表明FAK与肿瘤细胞的凋亡相关。Huang等[9]发现FAK通过活化PI3K/Akt及MAPK/ERK1/2信号存活通路而引发NFκB活化， 最终阻断caspase3级联反应， 使细胞凋亡受抑。因此FAK的表达与凋亡密切相关。本实验初步研究结果显示， 通过Hoechst荧光染色发现siFAK转染Caco2细胞48 h后细胞呈现凋亡的形态学变化: 核致密浓缩， 染色体断裂， 并出现凋亡小体等特征。从分子机制来说， FAKsiRNA可能通过下调FAK mRNA和蛋白表达水平而促使Caco2细胞凋亡。
实验中2个siFAK重组质粒对靶基因的抑制效应不同， 其中以siFAK1抑制FAK基因mRNA、 增殖及迁移的作用最为明显， 这种针对同一基因的不同靶点而产生的不同干扰效果， 可能与位置效应有关[10]。因此说明利用RNA干扰进行肿瘤临床治疗要对干扰序列进行筛选。
综上所述， FAK与肿瘤的发生、 发展密切相关， 我们的初步研究结果表明， 干扰FAK基因表达后使Caco2细胞增殖、 迁移力明显减缓、 细胞出现凋亡等现象， 且FAK基因表达受抑后胞质形态结构受损， 其机制可能与抑制Caco2细胞FAK mRNA和蛋白表达水平有关。因此靶向抑制FAK基因的表达， 可能是结直肠癌治疗的有效途径。此研究为RNAi在肿瘤治疗方面奠定了实验基础， 也为临床研究和进一步的治疗研发提供了更多的依据。
参考文献
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1 肿瘤MDR产生的机制
MDR的发生是肿瘤细胞从细胞膜、细胞质和细胞核内产生的多种途径综合作用的结果，其形成机制非常复杂，其产生机制如下。
1.1 膜糖蛋白介导的MDR
1.1.1 P糖蛋白介导的经典MDR P糖蛋白（Pglycoprotein，Pgp）是由多药耐药基因MDR1编码的一种分子量为170kD的跨膜糖蛋白，它属于典型的ABC(ATPbinding cassette)转运蛋白超家族成员[2]。Pgp是一个ATP依赖性的药物外排泵，能利用ATP水解释放的能量主动将疏水亲脂性化疗药物转运至细胞外，导致细胞内药物浓度低于杀伤浓度，从而使肿瘤细胞产生MDR[3]。
1.1.2 多药耐药相关蛋白介导的MDR 多药耐药相关蛋白（multidrug resistance associated protein，MRP）是由1531个氨基酸组成的分子量为190kD的跨膜糖蛋白[4]。它与Pgp有某种程度上的序列同源性，同属ABC转运蛋白超家族。MRP可通过促进谷胱甘肽结合药物从细胞内的排出而产生MDR[5]。
1.1.3 乳腺癌耐药蛋白介导的MDR 乳腺癌耐药蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）是由655个氨基酸组成的分子量为72.6kD的跨膜蛋白，属于ABC转运蛋白家族中的半转运蛋白，由一个疏水跨膜区和一个核苷酸结合区构成。两个BCRP分子通过二硫间形成同源或异源二聚体后才具有转运活性[6]。BCRP可以降低阿霉素、柔红霉素等在肿瘤细胞内的积累从而产生耐药性[7]。
1.1.4 肺耐药相关蛋白介导的MDR 肺耐药相关蛋白（lung resistancerelated protein，LRP）是一种分子量为110kD的蛋白质。LRP与Pgp、MRP、BCRP的作用机制不同，它主要通过核靶点屏蔽机制引起MDR，LRP可以使以细胞核为靶点的药物不能通过核孔进入细胞核，有些药物即使进入核内也会很快被转运到胞质中[8]。
1.2 酶介导的MDR
1.2.1 谷胱甘肽S转移酶介导的MDR 谷胱甘肽S转移酶(glutathionestransferase，GST) 是一组与细胞解毒功能有关的酶，分为α、μ和π等多种同工酶，各由GST 超基因家族的相应基因编码。GST 通过催化谷胱甘肽(glutathione，GSH)与药物结合，使两者形成复合物而解毒，导致肿瘤细胞产生耐药性。GST本身也可与亲脂性药物结合增加其水溶性，促进外排而降低化疗药物的细胞毒作用，同样也引起肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性。烷化剂和铂类药物均可通过这一途径解毒。
1.2.2 拓扑异构酶Ⅱ介导的MDR 拓扑异构酶Ⅱ（topoisomerase，TopoⅡ）是存在于细胞核内催化DNA双链拓扑异构体相互转换的基本核酶[9]，可改变DNA 的拓扑形式，参与DNA 复制、转录、重组和修复等许多重要活动。研究表明，TopoⅡ介导的MDR表纤维耐药细胞酶转录水平和活性降低，同时，TopoⅡ还可以参与特殊耐药基因的调控，合成出具有特殊排泵功能的膜蛋白，将药物泵出胞外，从而产生耐药。一般说来，TopoⅡ异常所致的MDR有以下特点：①对许多天然药物呈现抗药性；②膜活性药物不能提高抗肿瘤药物的细胞毒作用；③药物在细胞内聚积与外排无变化；④MDR1与Pgp表达未增加；⑤TopoⅡ含量及活性均有所下降。
1.2.3 蛋白激酶C介导的MDR 蛋白激酶C(proteinkinase C，PKC)是由一个超基因家族编码同源性很高的相关分子组成的一组酶，在MDR的发生、发展中起重要作用。研究发现，PKC几乎参与所有MDR机制的调节[10，11]。Pgp是PKC 催化磷酸化的底物，Pgp 磷酸化后可被激活，使其药物外排功能增强。另外，PKC 也可使MRP、LRP、GST 和Topo II 磷酸化，分别增强它们的活性。
1.3 凋亡调控基因介导的MDR
多数化疗药物是通过诱导肿瘤细胞发生程序性死亡(PCD) 即凋亡来达到治疗目的，反之，肿瘤细胞也可通过逃逸凋亡或拮抗凋亡获得生存，即产生多药耐药。目前研究比较多的是bcl2基因和p53基因。
1.3.1 bcl2基因 bcl2是最重要的细胞凋亡抑制基因，它位于18号染色体上（18q21）。bcl2基因过表达可以促进细胞的生存，同时也抑制放射线、化疗药物等诱导的细胞凋亡。bcl2基因转染bcl2低表达的肿瘤细胞，被转染细胞bcl2表达增强，对大多数细胞毒药物产生耐受[12，13]。用针对bcl2 mRNA的反义寡核苷酸处理多发性骨髓瘤患者的恶性浆细胞，bcl2蛋白表达量减少，并伴有凋亡增加和对化疗药物的敏感性增加[14]。临床上许多白血病和实体瘤细胞中bcl2基因的表达较高者，往往同时伴有放、化疗耐受。
1.3.2 p53基因 p53基因有野生型和突变型两种存在形式。野生型p53被视为细胞生长的“监控器”，能诱导DNA损伤的细胞进入G1/S期，抑制细胞增殖直至损伤DNA得到修复，若修复失败则诱导损伤细胞凋亡。当p53基因发生突变、缺失导致表达异常时（突变型p53），其对凋亡的控制也会发生异常，这时化疗药物所诱发的细胞凋亡受到抑制，导致肿瘤细胞对化疗药物的耐受显著增强。同时基因的突变也可能特异性激活MDR1/Pgp启动子使肿瘤细胞产生MDR。
其他参与凋亡调控的基因如cmyc、ras、fas/apo1、bcr/abl、cerB2/neu等也与肿瘤细胞耐药的发生相关联。
1.4 DNA异常修复引起的MDR
DNA是传统的化疗药物烷化剂和铂类化合物的作用靶点，它们通过直接破坏DNA结构的完整性引起DNA损伤而杀伤肿瘤细胞。这种DNA损伤的异常修复会使肿瘤细胞产生耐药性。涉及以下机制：(1)肿瘤细胞DNA鸟嘌呤碱基第6位氧原子烷基化导致细胞突变死亡是烷化剂的重要杀伤机制。O6甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(06methylguanine DNA ethyltransferaes，MGMT)可将DNA中O6甲基鸟嘌呤甲基转移至酶自身的半胱氨酸残基上，通过修复烷化剂对细胞DNA的损伤使细胞产生耐药性。(2)核苷酸切割修复(nucleotide excision repair，NER)是一种复杂的修复机制，能切除2729个碱基长度的DNA损害，理论上NER能切除任何使DNA双螺旋产生较大变化的DNA损伤。(3)错配修复(mismatch repair，MMR)能识别结构正常的非配对碱基间错配的微小改变。MMR系统缺陷使细胞识别DNA损伤的能力减弱，而不产生引起细胞凋亡的信号。MMR功能丧失导致基因组不稳定性增加，产生对抗癌药耐受的突变体。
2 肿瘤MDR的逆转策略
随着肿瘤细胞MDR分子基础和发生机制研究的不断深入，用不同手段和方法来克服肿瘤细胞的MDR已在实验和临床应用方面有了很大进展。目前常采用以下几种逆转策略。
2.1 化学药物治疗
针对肿瘤MDR的产生过程，应用多药耐药逆转剂是解决肿瘤MDR的主要手段。经过二十多年的开发研究，已发现大量具有MDR逆转活性的化合物，主要包括：钙通道阻滞剂(维拉帕米及其衍生物)、钙调蛋白抑制剂(噻吩嗪类化合物)、免疫抑制剂(环孢菌素A 及其衍生物)、类固醇和激素类似物(黄体酮、甲地孕酮) 等。但这类逆转剂的毒副作用也使其临床应用受到限制。
2.2 天然药物（中药）治疗
天然药物具有低毒、资源丰富、作用靶点多等特点。近年来许多学者把目光转向天然药物或中药，探索天然的肿瘤MDR逆转剂。研究证实有多种植物中药具有逆转MDR的作用，且逆转方式各有特点。
中药川芎嗪可下调MRP阳性表达率，使细胞内化疗药物浓度升高而逆转MDR[15]。人参皂甙可下调mdr1mRNA的表达，导致其产物Pgp减少，从而使抗癌药物在细胞内蓄积增加[16]。汉防己甲素（TTD）不仅能明显提高细胞内化疗药物浓度，且能明显增强化疗药物致细胞凋亡的作用[17]。千金藤素（CEP）通过降低NF κB活性，促进耐药细胞凋亡逆转MDR[18]。漏芦抽提剂RHU通过促进耐药细胞株凋亡，抑制肿瘤耐药基因MDR/ Pgp的表达从而显著逆转多药耐药[19]。 冬凌草甲素可明显诱导耐药细胞凋亡，显著地逆转K256/ A02 细胞对柔红霉素、高三尖杉酯碱的耐药性[20]。蝙蝠葛碱和蝙蝠葛苏林碱可竞争性地与Pgp结合，阻断化疗药物外排而增强VCR对BEL7402细胞的细胞毒作用[21]。浙贝母碱能直接抑制糖蛋白的表达，明显提高由Pgp或MRP介导的耐药肿瘤细胞内抗癌药物浓度[22]。茶多酚能明显增加MCF7 /ADR细胞对阿霉素的敏感性，且其耐药逆转机制可能是Pgp[23]。槲皮素能够下调MCF7/ADM细胞Pgp的表达从而逆转MCF7/ADM细胞的MDR [24]。鸦胆子油乳通过竞争Pgp 对其他化疗药物的结合位点，从而抑制药物泵出，在一定程度上逆转K562/A02，MCF27/ADM，KB/VCR等细胞的耐药性[25]。甲基莲心碱可抑制Pgp 的功能和表达，减少药物的外排从而克服MDR细胞的凋亡抗性[2627] 。葡萄籽多酚可能通过抑制Pgp 的表达、促进细胞凋亡而在体内、体外逆转MCF7/ ADM细胞的耐药性[2829]。榄香烯可下调抗凋亡基因bcl2的表达，促使耐药细胞凋亡[30]。
目前中药逆转剂的研究主要集中在体外实验，而对于其在体内的作用效果及安全性仍有待进一步的在体研究来验证。这在一定程度上也阻碍了中药在逆转MDR方面前进的步伐及其在临床的应用。
2.3 基因治疗
基因治疗是肿瘤治疗的新方法，MDR的基因治疗研究主要集中在MDR1 基因及某些癌相关基因。反义核酸技术、核酶技术及RNA干扰技术给耐药逆转提供了新的高效特异性的方法，较传统的MDR 逆转方法有较多优势。
2.3.1 反义寡核苷酸技术 反义寡核苷酸技术(antisense oligodeoxynucleotides，ASODN)是指用一段人工合成的能与RNA或DNA互补结合的寡核苷酸链来抑制基因的表达。应用反义寡核苷酸技术治疗MDR就是用一段人工合成的能与耐药相关基因在转录水平上相结合的核苷酸来封闭多药耐药基因转录，从而改变其MDR 特性。
将MDR1基因的ASODN 导入表达MDR1基因的耐药细胞后都可明显下调Pgp的表达，提高细胞内化疗药物浓度[31]。将ASODN的3'端与阿霉素共价连接后作用于KBA1细胞，可使KBA1细胞内阿霉素浓度比单用阿霉素组高6.4倍，比单用ASODN组高1.8倍[32]。应用MRP ASODN可下调乳腺癌耐药细胞MCF7/VP中MRP mRNA 表达[33]。多细胞卵巢癌球状体有高水平P27和Pgp表达，而且其对紫杉醇的耐药性较单层卵巢癌细胞更强。应用ASODN技术可以下调多细胞卵巢癌球状体中P27和Pgp表达，从而增强其对紫杉醇的敏感性[34]。当然，反义寡核苷酸较短的半衰期及较高的制备成本也使其广泛应用受到一定限制。
2.3.2 反义RNA技术 反义RNA技术指利用基因重组技术，构建人工表达载体，使其体外或体内表达反义RNA，从而抑制靶基因的表达。反义RNA是与多药耐药相关基因的mRNA形成二聚体而抑制mRNA翻译，从而逆转MDR。陈琳等[35] 应用自行构建的携带反义MRP的重组腺病毒体外转染人肝癌耐药细胞SMMC7721/ADM，使ADM、DNR对SMMC7721/ADM细胞的IC50分别为0.487μg/ml、0.328μg/ml，RF值分别为97.4、109.3，转染后24h，MRP mRNA水平开始下降并呈持续下降趋势，48h后伴有MRP蛋白表达的持续下降。表明MRP反义RNA可有效封闭MRP基因表达，有效逆转肝癌耐药细胞的MDR。陈纲等[36] 研究发现草酸铂、5Fu联合MDR1反义RNA对直肠癌耐药细胞有协同杀伤作用，可望成为治疗对5Fu耐药的直肠癌的有效方法。还有研究显示，MDR1反义RNA能下调人肝癌耐药细胞SMMC7721/ADM中MDR1 mRNA和Pgp表达，使阿霉素和柔红霉素对SMMC7721/ADM细胞的IC50分别下降了31.25%和62.96%[37]。反义RNA技术能够提高化疗药物的敏感性，有效逆转肿瘤MDR。
2.3.3 核酶技术 核酶是一类具有催化活性的RNA分子，它能特异性地识别mRNA中的GUC序列，并催化RNA的剪切反应，而其自身不被消耗可重复使用，具有高效率、高特异性、少副作用等特点。
特异性切割bcl2 mRNA 的核酶可有效地阻断bcl2 蛋白合成，明显促进紫杉醇诱导的细胞凋亡，提高紫杉醇化疗效果，克服耐药[38]。Kowalski等[39]用具有催化活性的抗BCRP的核酶处理257RNOV，结果发现257RNOVRzB1中BCRP mRNA 水平显著降低，米托蒽醌IC50 ( the 50% inhibitory concentration) 值也明显降低。王海等[40]利用核酶技术切割肿瘤多药耐药基因(MDR1)，结果发现，经抗MDR1核酶处理的人肝癌耐药细胞株Hep G2 MDR1 mRNA、Pgp明显降低，细胞内罗丹明聚集，对阿霉素的敏感性提高200倍。针对MDR1mRNA的二级结构设计的核酶（RZ135和RZ106）能够下调乳腺癌耐药细胞中MDR1mRNA和Pgp的表达，抑制Pgp的外排功能[41]。
2.3.4 RNA干扰技术 RNA干扰(RNA interference，RNAi)是含21～23个核苷酸的小分子干扰RNA 片段(small interference RNAs，siRNA) 特异性地识别并降解其同源基因mRNA，诱导序列特异性基因沉默的过程。现已广泛应用到基因功能、基因表达调控等热门领域，为基因治疗开辟了新的途径。
张晓菁等[42]用脂质体介导将MDR1特异性siRNA的表达载体(pSN/ mdr1a 和pSN/ mdr1b) 转染阿霉素耐药细胞株OVCAR/ AR和多药耐药亚株OVCAR/MDR细胞，可显著抑制两株耐药细胞MDR1 mRNA 和Pgp的表达，OVCAR/MDR 和OVCAR/AR 细胞对阿霉素抗药性的逆转率分别为79.5%和93.9%。表明载体表达的MDR1特异性siRNA可抑制卵巢癌耐药细胞MDR1基因的表达，增加耐药细胞对化疗药物的敏感性。转录相关锌带蛋白基因(zinc ribbon domaincontaining 1 protein，ZNRD1) 可能通过类似转录因子的转录调节作用参与肿瘤多药耐药[43]，朴瑛等[44]构建了ZNRD1 基因的siRNA 载体并将其转导入HL60/VCR细胞，转染后的细胞对长春新碱和阿霉素的敏感性增强，且低表达Pgp 和bcl2 ，该siRNA真核表达载体在一定程度上逆转了白血病细胞的耐药性。抗ABCG2的siRNA和短发夹RNA可完全抑制ABCG2 mRNA及其转运蛋白的表达，而且抗ABCG2的短发夹RNA使耐药细胞中化疗药物浓度累积到亲代敏感细胞水平[45]。与传统反义RNA技术相比，RNAi设计更简便、作用更迅速、效果更明显。
3 展望
肿瘤多药耐药的问题仍然是目前临床治疗所面临的主要困难之一，对其进行全面深入的研究将有助于恶性肿瘤的治疗。临床逆转试验的根本性突破，还有待于MDR机制的进一步明确。随着高效低毒逆转剂的不断发现以及基因治疗技术的不断发展并逐渐应用于临床，肿瘤对化疗药物的耐药性将会被克服。
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一、福建省血液病专业和福建省医学会血液病学分会的发展史
福建省医学会血液病学分会是福建省血液病临床和实验研究工作者的群众性学术团体。我省血液病学专业早在五十年代就在当时的福建医学院附属协和医院开展，是全国较早开展血液病学研究的省份之一，当时临床研究主要是常见血液病、白血病和淋巴瘤的治疗。基础研究“红细胞内游离原卟啉”的研究曾获1978年全国医药卫生科学大会成果奖。1978年我省的“三尖杉酯碱治疗白血病的研究”获全国科技大会成果奖。同年福建省血液病研究室成立，挂靠在当时的福建省人民医院和三明地区第一医院。研究室于1988年7月经省编制委员会批准，扩大升为福建省血液病研究所。
1987年10月在龙岩市召开福建省第四次血液病学术会议，成立了福建省医学会血液病学分会，并已分别于1991年、1998年、2004年进行换届改选，历任主任委员为：叶德富、黄淑桦、陈元仲、胡建达，吕联煌教授为名誉主任委员。分会创建以来，400篇以上，主编和参编20多部专著、教材和参考书。有70项左右科研及教学成果获国家、部省及省厅级科技成果奖，其中国家级科技成果奖3项。目前分会共有45名委员。
分会挂靠单位为福建医科大学附属协和医院、福建省血液病研究所，研究所是一所集医疗、教学、科研于一体的应用型研究所，是福建医科大学内科学（血液病学）博士点和重点学科，临床医学博士后科研流动站，福建省高等院校"211工程"重点学科，福建省科技厅的优先发展研究所，福建省教育厅和福建省卫生厅的重点学科，又是国家药品临床研究基地。目前全所有医、护、技等专业技术人员75人，其中，教授7人，国家级专家3人，博士生导师4人，硕士生导师8人，有博士学位9人，硕士学位11人。研究所所长是吕联煌教授。
研究所分临床病房、临床血液实验室和基因工程实验室等三部分。临床部分为协和医院第十二、十三两个病区，共有病床109张，包括骨髓移植病床6张，还有全日制血液病专科门诊。临床血液实验室有血细胞形态室、血液生化室、止血血栓室、流式细胞室等4个实验室。基因工程实验室有基因诊断室、基因测序室、DNA/RNA合成室、核酸纯化室、变性高效液相色谱室、细胞库、无菌级动物实验室等。研究所是全省血液病的诊疗和教学科研中心，为来自省内、外的白血病、恶性淋巴瘤、贫血、出血及其他血液病病人提供医疗服务，并为省内、外医院培养血液病专业技术人才。
目前研究所的主要研究方向有：⑴血液病诊疗规范化及个体化研究；⑵血液肿瘤的转录基因组学、蛋白质组学和基因治疗研究；⑶细胞因子与造血调控的研究；⑷植物有效成份抗白血病活性的研究；⑸造血干细胞移植的基础和临床研究。
除福建省血液病研究所外，我省部分地市级医院也成立血液病研究机构，如三明市血液病研究所，泉州市第一医院血液病研究室，漳州市立医院血液病研究室等。目前各地市级以上医院均有血液病专科医生和专业病床，部分县级医院有血液病专科医生。泉州市还成立了泉州市医学会下的血液病专业委员会。
二、近年来福建省血液病学学科进展
下面就我省血液病学科的临床与基础研究进展概述如下:
(一)临床研究
1.真性红细胞增多症
真性红细胞增多症是一种骨髓增殖性疾病，传统治疗方法主要有化疗和放射治疗，副作用大。由吕联煌教授主持下应用三尖杉酯碱治疗真性红细胞增多症，有很好的疗效。五项指标（完全缓解率、达完全缓解中数时间，完全缓解持续时间、复发率、复发时间）全面对比，这种新疗法优于目前国内外治疗该病的其他疗法，具有疗效好、见效快、价格廉、副作用小、不诱发白血病等优点，是国际首创的，较理想的一种新疗法。研究论著在中华内科杂志发表[1]，受到国内外同行专家的重视。法国医学杂志转载论文摘要，法国、美国等外国专家来信索取研究资料，美国医生来信联系有真性红细胞增多症病人因治疗效果不佳，希望来中国住我院采用三尖杉酯碱治疗。本研究成果已在国内推广应用，许多医疗单位应用后同样取得很好的疗效，获得明显的社会效益和一定的经济效益。该成果荣获1987年国家科学技术进步奖。
2.再生障碍性贫血（AA）
再生障碍性贫血是造血系统“重症”之一，近年，国内、国外学者对AA的认识较传统观念有了明显进步,众多研究表明细胞免疫异常是AA发病机制中的主要环节。免疫抑制治疗是AA的主要治疗方法。该类治疗主要包括抗淋巴细胞球蛋白/抗胸腺细胞球蛋白(ALG/ATG)、环孢霉素（CSA）、肾上腺皮质激素类、大剂量静脉人血丙种球蛋白、环磷酰胺及异基因骨髓移植前的预处理等。我省自上世纪九十年代将ATG/ALG用于治疗SAA，现已成为AA（特别是SAA）主要的免疫治疗手段。该类制剂治疗AA的机制主要是抑制或破坏T淋巴细胞。ATG/ALG多不单用，可与CSA、雄激素、造血刺激因子合用。联合方案有效率可高达50--60%左右，并有取代干细胞移植趋势。
CSA是用于AA的另一种免疫抑制剂。CSA与ATG/ALG在AA治疗上有互补作用，故联用效佳。单用CSA加雄激素合用治疗AA也有相当的疗效，但起效慢。
除上述药物治疗外，我们也开展异基因造血干细胞移植治疗AA，一些病人获得痊愈，但开展例数尚少。
3.急性白血病（AL）
白血病病因仍不明确。对白血病病因学的研究，我省的吕联煌教授领导的课题组首次发现我国有人类T细胞白血病病毒流行区及其传染方式[2]，为防止这种致命的白血病病毒流行在全国蔓延扩大做出了贡献，基因测序研究首次发现我国HTLV-1与国外报导不同，这一发现对了解HTLV-1感染源有重大意义，并有助于了解世界HTLV-1流行及分布特点，成果获1997年国家科技进步奖三等奖及1998年萍科技奖二等奖。
由于白血病细胞起源、分化和生物学行为不同，构成了白血病的异质性，因此急性白血病的全面、正确分型是准确、及时治疗的前提。随着免疫学与生物学的进展及应用，急性白血病的诊断技术也有很大发展，国际血液病学家及血液病理学家于2001年3月在里昂会议上建议造血和淋巴组织肿瘤的WHO分类法，就是应用MICM方法力求反映疾病本质，成为国际上一种新的分类标准[3]。
为了与国际接轨,近年来省内也渐开展MICM分型方法,但目前尚待进一步完善中,已开展白血病融合基因检测,用于临床诊断。
急性髓细胞白血病(AML)治疗主要是联合化疗、诱导分化、造血干细胞移植、免疫化疗、基因靶向治疗等。我们在临床上对AML诱导治疗一般采用标准诱导方案DA（3+7）或IA（3+7），≤60岁AML患者，CR可达75%～80%，OS约为30%;≥60岁AML CR率为40%～55%，OS为10%～15%,接近国际先进水平。为了提高CR率，我们也进行临床试验研究,如蒽环类药增量，加大阿糖胞苷量，或加用其他化疗药物如VP-16、VM26、氟达拉宾、拓扑替康等，同时还可用预激方法（G-CSF、GM-CSF）促使白血病细胞进入细胞分裂周期等。 缓解后化疗对＜60岁的AML患者有明显疗效。对于中危患者可用3～4个大剂量阿糖胞苷后进行异基因干细胞移植。对于高危AML患者在CR后应立即进行异基因干细胞移植。
急性早幼粒细胞白血病（APL）是AML中的一种亚型，临床以出凝血异常导致的出血为特征，血象常表现为白细胞不高，骨髓中颗粒增多的异常早幼粒细胞增多，细胞遗传学检查有特异性改变，分子生物学可以检测到早幼粒细胞白血病-维甲酸受体a（PML-RARa）融合基因。近十多年来对APL的研究取得较大进展，随着从临床到基础、从基础到临床的不断反复，化疗、维甲酸、砷剂、新研发的分子靶向性药物成为APL治疗的4个里程碑，使得APL成为仅通过药物即可能达到治愈的恶性血液病，同时分化诱导治疗的成功也为其他肿瘤提供了一条新的思路[4]。在临床上我们常规使用ATRA联合亚砷酸治疗APL，CR率大于90%，与国内外先进水平相仿。
急性淋巴细胞白血病（ALL）是一组生物学和预后不同的异质性疾病。近年来在分子生物学上的进展为临床上根据细胞遗传学特征更为准确地识别预后不同的ALL，并根据其危险度调整治疗策略，使治疗更加个体化和高效低毒。
我省成人ALL最常用的诱导缓解方案包括长春新碱、泼尼松、蒽环类、L-门冬酰胺酶和环磷酰胺(CTX)等。CR率达到80%～85%,中位缓解时间约为18个月,用地塞米松(DX)替代泼尼松,表现出更强的抗白血病活性和脑脊液中更高的药物水平。上述联合用药方案已经能够获得相当高的缓解率,但强烈的诱导缓解可能会对疾病缓解时间和长期生存产生积极的影响，如在T-ALL加用Ara-C和CTX,在成熟B-ALL分次应用CTX和用大剂量甲氨喋呤(MTX)等。
巩固治疗包括改良的诱导缓解方案,序贯的巩固治疗方案和造血干细胞移植。目前的治疗策略倾向于根据亚型和疾病危险分组调整巩固治疗方案，我们也参考国外强烈的化疗方案HyperCVAD，分次给予CTX、大剂量Ara-C和MTX。
HLA匹配的相关供者的干细胞移植（SCT）已经被应用于治疗各种类型的成人ALL。在CR1后用HLA相配的异基因SCT治疗的生存率约为50%。
Ph+ALL发生率与年龄显著相关，在ALL中总的发生率为20%～30%，随年龄增长发生率增高，尽管60%的病例能获得CR，但大多数病例会复发，其5年的DFS低于10%～20%。伊马替尼是一种选择性bcr-abl酪氨酸激酶抑制剂，用于治疗Ph+ALL显示出良好的应用前景。我们应用伊马替尼治疗复发和耐药的Ph+ALL，能使其获得血液学或骨髓反应，但其持续时间较短，很快发生继发耐药，这反映了其单药治疗的局限性，必须与其他药物联合应用以克服耐药。
对于难治复发的白血病患者,我们吸收、应用国际上先进方案FLAG、CAG、B-NHL86等治疗方法，白细胞去除术抢救高白细胞性急性白血病,也取得一些疗效。
4.慢性粒细胞白血病（CML）
慢性粒细胞白血病自从被描述至今已有一个半世纪之久，但治疗进展十分缓慢，中位存活期3-4年。上世纪七十年代开创的异基因骨髓移植使CML患者有了治愈的可能。上世纪八十年代干扰素的应用是第一个可使少数CML慢性期患者获得遗传学缓解的药物，但该药对CML进展期无效，亦不能 防止急变且患者须长期接受注射，易受多种副作用困扰，耐受性差。直至上世纪末特异性、靶向性治疗药物-甲磺酸伊马替尼的问世，才为CML的治疗开创了新纪元[5]，超过三分之二的慢性期患者和少数加速期患者有获得完全遗传学缓解甚或主要分子生物学缓解的可能，提高患者的生存质量。特别是使急变期患者转变为慢性期，获得机会去做异基因干细胞移植而长期生存。现在伊马替尼已在我省广泛应用于慢粒治疗,取得明显效果。也有相当一部分病人接受异基因造血干细胞移植而治愈。
5.慢性淋巴细胞白血病（CLL）
慢性淋巴细胞白血病是一种B淋巴细胞肿瘤。根据WHO的定义，CLL与小淋巴细胞淋巴瘤（SLL）同属一种疾病，是SLL的白血病表现形式。过去所谓的T-CLL现归属于T细胞幼淋巴细胞白血病。在我国，CLL仅占白血病的4.6%。
CLL的分期对判断患者的预后和决定何时开始治疗有重大意义。Rai分期法和Binet分期法根据淋巴结、肝脾肿大情况和红细胞、血小板的减少程度将CLL作了分析，指导临床治疗，沿用多年。但是，仅依靠临床表现的分期，不能准确预测哪些低危患者的疾病将会进展。据文献报告，ZAP-70（Zeta链相关蛋白-70）和CD38等检查结果有助于预测疾病活动程度。从今年开始,我省对慢淋病人进行ZAP-70和CD38检测,以指导治疗。
治疗方案的选择：首选治疗方案以嘌呤类似物为主，如氟达拉滨、氟达拉滨+美罗华等；也可选用经典的瘤可宁+强的松或COP及干扰素治疗。
6.恶性淋巴瘤
我国报告的恶性淋巴瘤绝大多数为非霍奇金淋巴瘤(NHL),HL不足10%。在NHL中,中高度恶性淋巴瘤所占比例又高达80%以上。由于淋巴瘤中存在TCR和IgH基因重排,PCR可以区别反应性增生淋巴结病还是恶性淋巴瘤。淋巴瘤分型也因此由病理、免疫发展到核型和分子病理学分型的阶段。治疗上除应用传统的化、放疗外,还采用氟达拉滨、针对CD20靶向免疫治疗药物-美罗华等新疗法[6]，提高疗效。自体骨髓移植和异体造血干细胞移植治疗恶性淋巴瘤,不仅使许多病例延长了生存期,而且使其中部分病例获得治愈。对于疗效的监测，我们也应用最先进的PET-CT影像学技术定期随访病变情况。
7.多发性骨髓瘤（MM）
多发性骨髓瘤是浆细胞的恶性肿瘤。如不进行治疗，进展期MM患者的中位生存期仅为6个月。常规化疗的治疗有效率为40%~60%，完全缓解率低于5%，中位生存期不超过3年。约25%的患者能存活5年以上，存活10年的MM不到5%。对于新诊断的多发性骨髓瘤患者,我们采取MP,VAD加沙利度胺等方案治疗,相当部分的病人病情控制稳定。近几年来随着对MM生物学特性的深入研究，形成了新的治疗思路，着眼于MM细胞内信号通路，骨髓微环境及二者的相互作用，涌现出一批新的靶向药物如蛋白酶抑制剂万珂，与传统化疗以及造血干细胞移植等治疗手段的联合极大地提高了MM治疗的有效率，特别是CR率，但在我省只有个别病例使用，尚待更多的临床疗效观察。
8.骨髓增生异常综合征（MDS）
骨髓增生异常综合征是一组起源于造血干细胞的获得性克隆性疾患，其特征性病理改变是克隆性造血干/祖细胞发育异常和无效造血，其基本临床特征是骨髓中造血细胞有发育异常的形态学表现和外周血中血细胞减少，转变为急性髓性白血病的危险性很高。2001年，WHO颁布造血组织和淋巴组织肿瘤新的分类方案中将MDS的诊断分型与1982年FAB标准相比做了一些修订,特别是将MDS和AML骨髓原始细胞的分界降低为0.20，取消了RAEB-t亚型。MDS的治疗对于大多数病程平稳，主要表现顽固性血细胞减少，而基本上没有恶性表征的患者，治疗目标应是提高血细胞数量和保持较好的生活质量。我们在临床上主要采用小剂量阿糖胞苷等的诱导分化治疗和支持治疗。
9.特发性血小板减少性紫癜（ITP）
特发性血小板减少性紫癜是一种免疫介导的血小板减少综合征，是临床最常见的出血性疾病，约占出血性疾病总数的30%。ITP为自身免疫性疾病，目前尚无根治的方法，治疗上主要采用免疫疗法。治疗的目的是使患者的血小板计数提高到安全水平，防止严重出血，降低病死率；而不是使患者的血小板计数达到正常。泼尼松仍是ITP一线治疗药物，大剂量地塞米松也在临床取得满意的效果。应用大剂量地塞米松时，应注意检测血压、血糖的变化，并注意预防感染，保护胃粘膜。大剂量静脉用丙种球蛋白也在临床上用于抢救重型ITP患者。
10.造血干细胞移植的进展
自上世纪60年代造血干细胞移植应用于临床开始，移植技术不断进步，日趋成熟，亦更为安全有效，已经成为治愈各型白血病、淋巴瘤等恶性血液病及再障、某些实体瘤、自身免疫性疾病及部分遗传性疾病的有效方法。
异基因造血干细胞移植中有近85%是同胞全相合异基因造血干细胞移植（Allo-HSCT），是目前应用最多也是最为成熟的异基因移植方式。单倍型HSCT和非清髓HSCT在临床上也有开展。
我省首例造血干细胞移植于1990年由福建医学院附属协和医院开展，当时对一名急性淋巴细胞白血病青年行自体骨髓移植成功，之后福州总医院，福建医科大学附属第一医院，福建省肿瘤医院，泉州市第一医院，三明市第一医院，龙岩市第一医院，厦门市第一医院相继开展自体造血干细胞移植。异基因造血干细胞移植在此基础上也迅速开展。1996年，福建省肿瘤医院首先开展外周血干细胞采集，并开展自体外周血干细胞治疗实体瘤。2000年，福建医科大学附属协和医院与福建省肿瘤医院合作，开展异基因外周血干细胞移植治疗慢性粒细胞白血病，此例移植后至今仍然在工作岗位上。此后在福州总医院、福建医科大学附属第一医院、泉州市第一医院、厦门市中山医院、漳州市医院均相继开展异基因外周血干细胞移植，病种覆盖急慢性白血病、恶性淋巴瘤、急性再生障碍性贫血和阵发性睡眠性血红蛋白尿等。2002年，福建医科大学附属协和医院开展我省首例非亲缘造血干细胞移植治疗慢性粒细胞白血病，之后非亲缘造血干细胞移植治疗血液系统恶性肿瘤相继在厦门市中山医院和泉州市第一医院开展。2004年起，福建医科大学附属协和医院开展供者淋巴细胞输注治疗骨髓移植后复发的白血病的研究。
我省自体造血干细胞移植例数超过150例，除应用于血液系统恶性肿瘤外，还包括风湿病等自身免疫性疾病。异基因外周血造血干细胞移植例数超过120例,非亲缘造血干细胞移植18例。我省也积极参与中华骨髓库的资料登记,已外送非亲缘造血干细胞21例。龙岩市第一医院开展造血干细胞移植治疗血栓闭塞性脉管炎取得良好疗效。
(二)基础研究
1.基因治疗研究:主要开2个主要方面的研究,即核酸药物及免疫基因治疗。重点开展抗癌基因新药反义核酸的研究，设计和研制成功抗癌基因新药Bcl-2反义核酸，药效学研究发现它对白血病和恶性淋巴瘤裸鼠移植瘤有良好的疗效，单独应用时能诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤生长，与化疗药物联合应用时，能逆转肿瘤对化疗药物的耐药性，提高治疗效果。并进行ASODN临床前的药效学、药代动力学及毒理学实验，是国内最早开展抗癌基因药物反义核酸的研究单位之一，"Bcl-2反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸对白血病细胞系基因治疗的系列研究"获2000年省科技进步三等奖。RNA干扰（RNAi）是1998年以来发现和发展起来的一门新兴的基因阻断高新技术，小干扰RNA（siRNA）代替反义核酸进行转录后基因沉默，已经应用到基因功能和基因治疗研究中。我科在开展反义核酸研究的基础上，正在开展siRNA的设计、研制和抗肿瘤效应研究。同时开展抗bcr/abl融合基因核酶对慢性粒细胞白血病基因治疗及自体骨髓净化研究，有望用于CML自体骨髓移植的体外净化，并对野生型p53基因诱导白血病细胞分化凋亡的机制进行研究。
基因免疫治疗方面的研究有基因瘤苗治疗淋巴瘤和白喉毒素真核表达载体构建及其对B细胞恶性肿瘤的选择性杀伤作用的研究，取得了较好的实验结果，成功地构建了含Igκ轻链基因启动子/增强子抗百咳毒素A链基因的真核表达载体，转染表达Igκ轻链肿瘤细胞（CA46细胞），发现其能特异性抑制CA46细胞增殖。还应用基因工程技术，制备GM-CSF和B7.1基因修饰的淋巴瘤细胞瘤苗，它能有效地激发亲本小鼠抗淋巴瘤免疫反应，具有潜在的临床应用价值，有望用于清除淋巴瘤微小残留病。以上这些研究总体居国内先进水平，有些为国内率先开展、报告。
2.开展细胞因子与造血调控的研究:主要涉及以下几方面：①血小板反应蛋白（TSP）以及类肝素物质对巨核细胞生长的作用及其机制；②正常血细胞分化各阶段及各个类型白血病细胞的细胞因子及其受体表达的研究；③急性白血病TGFβ1水平的变化及意义；④外源性TGFβ1、wt-p53、全反式维甲酸、三氧化二砷调控白血病细胞因子和受体以及bcl-2、c-myc、端粒酶活性表达及其与白血病细胞分化、凋亡的关系；⑤TGFβ1、TNFα、反义寡脱氧核苷酸对白血病细胞凋亡和造血干细胞体外扩增的影响。取得如下结果：①在国际上首次发现TSP是巨核细胞生成的负调控因子并发现其功能基团，类肝素物质-藻酸双酯钠对CFU-MK的形成具有刺激作用；②CD34+造血干细胞表达多种正性细胞因子及受体，随着细胞分化成熟，正性细胞因子表达逐渐减少，而负性细胞因子TGFβ1、TNFα则持续存在；③白血病细胞亦可同时表达多种正性细胞因子，但作为最强的负性细胞因子TGFβ1在急性白血病的表达水平低于正常人，急性白血病缓解后，TGFβ1水平恢复正常，复发患者其TGFβ1水平又趋降低，并发现原代急性白血病细胞存在TGFβ1Ⅱ型受体异构体。说明白血病细胞存在正、负细胞因子失衡；④全反式维甲酸、wt-p53、三氧化二砷诱导白血病细胞分化凋亡过程中，伴有内源性TGFβ1、TNFα表达上调，bcl-2、c-myc表达下调，端粒酶活性下降，而反义TGFβ1、TNFα寡脱氧核苷酸能够阻断细胞凋亡的发生，并使bcl-2表达水平恢复，提示内源性TGFβ1、TNFα是促进白细胞分化的内在动力。⑤TGFβ1、TNFα反义寡脱氧核苷酸可提高CD34+造血干细胞数量和CFU-GEMM集落数，提示阻断内源性TGFβ1、TNFα可能是造血干细胞体外扩增的有效途径之一。
上述研究成果多为国际上首先报道，丰富了造血及白血病的基础理论知识，系列研究在《Br. J. Hematol》[7]、《J Lab Clin Med》等刊物上，并在国际学术会议上做报告。
3.开展植物有效成分治疗白血病的研究:这方面有较好基础，是国内最早开展三尖杉酯碱治疗白血病研究的单位之一，获得全国科学大会奖；并设计以三尖杉酯碱为主的HOAP方案治疗急性白血病，还在国际上首创三尖杉酯碱治疗真性红细胞增多症新疗法，获国家科技进步三等奖。我们在国际上率先开展了雷公藤内酯醇治疗白血病的实验、临床研究以及姜黄素治疗白血病及淋巴瘤的实验研究，取得了一系列创新性成果。雷公藤内脂醇与多种抗癌药物具有协同作用，能逆转白血病细胞的耐药性，其抗癌机制可能是通过抑制白血病细胞bcl-2的表达并激活Caspase-3而发挥作用。它还可通过下调Ras/Raf/MEK/Erk途径的信号传导，最终减少转录因子c-Jun的含量而抑制细胞的增殖。在相关实验研究基础上，首次进行雷公藤内酯醇（国产抗肿瘤一类新药）Ⅰ~Ⅱ期临床研究，发现该药具有良好的抗白血病作用，有望成为一种抗白血病的新药。本学科还通过从天然植物姜黄中提取姜黄素，研究姜黄素对慢粒细胞系K562细胞的抗癌活性及其对酪氨酸激酶的影响，结果表明姜黄素可特异性下降P210蛋白的表达，抑制其激活的Ras信号途径，从而抑制细胞增殖；引起国内外的关注，其中"姜黄素的抗癌活性及其对癌细胞周期与信号转导的影响"获得由欧洲肿瘤学会、中国癌症研究基金会联合颁发的2001'DEBIO-CCRF中国奖，相关研究还获省科技进步二等奖，并获中国专利1项。此外，进行姜黄素对HL60细胞及CA46细胞的抗癌活性研究，发现姜黄素能通过下调c-myc、bcl-2、突变型P53及上调Fas的表达而抑制HL60细胞和CA46细胞增殖，诱导细胞凋亡。目前正在扩大姜黄素对恶性血液病治疗的实验研究，如对多发性骨髓瘤细胞株U266的作用，初步研究结果显示其对骨髓瘤细胞有增殖抑制作用并诱导细胞凋亡，其机制目前正在研究中。由于姜黄素对正常细胞毒性低，因而是一种很有开发前景的抗白血病新药，该研究课题获国家教育部资助，并是福建省自然科学基金重大项目课题，目前我们还研究该药抗白血病的分子机制，上述研究已产生或将产生明显经济及社会效益。
其他正在研究的植物单体成份还有大黄素等，同样也有类似的抗白血病效应。
4.开展骨髓净化的实验研究:系统研究了烷化溶血磷脂（ALP）对急慢性白血病骨髓的净化作用，采用ALP和Bcl-2反义核苷酸提高净化疗效。针对慢性粒细胞白血病（CML）自体骨髓移植效果差的问题，研究了CML自体树突状细胞活化的骨髓细胞净化CML骨髓，结果表明对Ph阳性CML有肯定的净化效果。还在国际上首先研究光敏剂ZnPc-PDT对正常造血细胞的影响及对白血病细胞的杀伤作用，同时对模拟缓解骨髓中K562细胞的净化作用也作了研究，并在体外研究其净化效果及对HL60细胞的体内杀伤作用，进而联合ZnPc-PDT与免疫瘤苗治疗小鼠淋巴瘤。研究表明ZnPc-PDT具有体内外抗血液肿瘤细胞的作用，对体外实验时正常MNC中掺入的K562细胞及体内实验时骨髓移植物中掺入的EL9611细胞有较好的净化作用，与免疫瘤苗联合发挥显著的抗淋巴瘤效应，为ZnPc-PDT应用于治疗血液肿瘤临床提供了实验依据。在恶性血液病的免疫治疗方面，采用供者淋巴细胞输注联合小剂量化疗治疗骨髓移植后复发的白血病，观察到一定的治疗效果，为进一步深入开展白血病的过继免疫治疗打下基础。应用烷化溶血磷酯反义技术、树突状细胞及信号传导阻滞剂用于白血病骨髓净化的研究已经得取了阶段性成果，并继续深入研究中。
三、教学及学术交流
分会积极培养高层次人才，挂靠单位福建医科大学附属协和医院、福建省血液病研究所创建基因工程实验室，引进先进的分子生物学仪器设备，开展高水平的科研工作，使学科具备较强的科研实力和较高的学术水平，部分研究成果具有国内领先和国际水平，1982年成为福建医科大学临床医学硕士点，1990年成为福建医科大学第一个临床医学博士点，2001年经国家批准为福建医科大学临床医学博士后科研流动站，已培养博士生40名，硕士生77名。
分会在积极培养高层次人才同时，不忘为我省培养年轻医师，组织培养全省各级进修、轮转及通科培训人员。承担福建医科大学医疗系、口腔系、检验系、预防医学系、高护系、麻醉系、影像学系、美容、卫管、全科等各专业本科、医专班以及成人教育班的诊断学、内科学、临床医学概论、临床血液学及实验血液学的教学工作，包括上大课、实验课，同时还承担医学系、检验系的临床见习教学及实习指导任务。认真抓好教学工作，经常进行教学查房、专科讲座、技能操作培训，为实习及见习同学创造良好环境。
分会积极组织开展省内、国内及国际学术交流活动，邀请国外专家举行专题讲座，分会委员参加国际血液病学术会议，赴国外学术机构进修学习。为提高学科专业技术水平与促进学科发展，定期开展全省血液病学术交流活动，疑难病例讨论会，至今共召开了十一次全省血液病学学术会议，承办了3次全国性血液病学学术研讨会。
虽然分会近年来取得了一些成绩和进展,但与国内外先进机构相比还有相当差距,今后更要努力加快工作,发挥优势,争取赶上国内外先进水平。
参考文献:
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[6]Czuczman MS,et al.Treatment of patients with low-grade B-cell lymphoma with the combination of chimeric anti-CD20 monoclonal antibody and CHOP chemotherapy. J Clin Oncol 1999,17:268.
[7]Yuanzhong Chen, et al. Interleukin-3 is an autocrine growth factor of human megakaryoblasts ,the DAMI and MEG-01 cells. Br J Haematol 1994,88:481.
课题组成员：
1.胡建达: 教授，主任医师，博士生导师,福建省血液病研究所副所长
2.杨凤娥:福建省血液病研究所主任医师
