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1材料与方法
1.1材料烟草青枯病土壤取自贵州省烟草科学研究所福泉烟草青枯病病圃。五点混合法采集土壤样品，取土壤表层8~20cm的土层，过0.2mm筛，去除杂质。微生物保守区域片段的扩增引物（表1）由上海生工生物有限公司合成；琼脂糖凝胶回收试剂盒、DNAMarker、dNTPs、DNA聚合酶、连接酶、克隆载体等试剂购自大连宝生物（TAKARA）有限公司；序列测定由上海生工生物有限公司完成。
1.2方法
1.2.1土壤总DNA的提取和检测采用玻璃珠均质和液氮研磨法相结合以及SDS-CTAB法，提取病圃土壤中微生物DNA，用纯化试剂盒纯化获得DNA。采用琼脂糖凝胶电泳法检测土壤微生物总DNA和PCR扩增产物。
1.2.2PCR扩增与DNA纯化以土壤微生物总DNA为模板，8f，926r；338F，518R为引物对进行PCR扩增。反应体系总体积为25.0μL，其中模板（土壤DNA）1.0μL，正向引物和反向引物（10μmol/μL）各1.0μL，10×PCRBuffer（含有Mg2+）2.5μL，dNTP（2.5mmol/μL）1.0μL，Taq（5U/μL）0.2μL，蒸馏水补体积至25.0μL；反应程序：95℃预变性5min；94℃变性40s，55℃变性50s，72℃延伸1min，32个循环；最后，72℃延伸10min。按照TAKARA公司凝胶回收试剂盒说明书操作，对PCR扩增产物进行回收，用琼脂糖凝胶电泳检测回收产物。
1.2.3微生物多样性初步分析保守区域文库中检测为阳性的单克隆由上海生工生物公司测序。获得的序列信息通过NCBI数据库(ncbi.nlm.nih.gov)及EzTaxon网站()进行在线分析和比对。
2结果与分析
2.1烟草青枯病土壤微生物总DNA提取琼脂糖凝胶电泳检测提取纯化后的土壤微生物总DNA，结果显示提取的DNA大小约在2.0~10.0kb范围之间，通过DNA试剂盒的纯化，可以降低土壤中腐植酸以及多酚类等化合物对PCR反应的影响。2.2烟草青枯病土壤微生物16S-rRNA和ITS保守序列文库构建以纯化的DNA为模板，用细菌特异性8f和926r引物、真菌特异性338F和518R引物，经过PCR扩增，获得与预期片段大小一致的条带，分别在1000bp和300bp左右。分别用8f，926r引物；338F，518R引物扩增的产物构建文库，从文库中随机挑取部分单菌落，用PCR方法检测其携带的片段，部分琼脂糖电泳检测结果如图所示，图1表明随机挑取的大多数单菌落携带有目的条带。阳性克隆的序列的测定由上海生工生物有限公司完成。
1.新技术在环境工程生物处理研究中的应用
由于PCR-DGGE技术克服了传统微生物学方法的局限性，自Muvzer等开辟了DGGE在微生物生态领域研究的先河以来，该技术迅速发展成为环境微生物群落结构分析研究的主要手段之一。近年来，DGGE 用于环境微生物种群的研究越来越多，涉及的领域也越来越广泛，在国外DGGE技术已经被广泛用于活性污泥、生物膜等生物处理系统中的微生物多样性检测、微生物鉴定以及种群演替等方面的研究，在国内这方面的应用虽然处于起步阶段，但也成为研究的热点。
1．1在废水生物处理研究中的应用
PCR-DGGE技术在废水生物处理研究中的应用使人们对废水处理过程中微生物群落的变化产生了新的认识。
Lapara等研究了升高温度对废水好氧生物处理过程中细菌群落结构和功能的影响，DGGE分析细菌群落的结果表示不同温度下有不同的细菌群落。
应用PCR-DGGE方法，对在相同的操作条件下分别用低温菌和常温菌接种的两套活性污泥系统中的微生物群落结构的动态变化进行了追踪。由于工艺相同，使得接种的低温菌群和常温菌群在相同的操作条件下，产生了相似的微生物群落结构。随着运行时间的增加，其菌群结构相似程度也越来越高。
硝化作用是废水处理系统中实现氨氮去除的关键步骤。而氨氧化细菌在硝化作用过程中负责将氨氧化为亚硝酸盐，实现亚硝化作用，是硝化过程中必不可少的步骤。但由于氨氧化细菌的生长速率相当低，生物量很少，采用传统的细菌分离培养分析法研究氨氧化细菌相当费时、繁琐。许玫英等采用PCR扩增16SrDNA、扩增功能基因、随机克隆测序等技术，分析处理含高浓度氨氮废水处理系统不同驯化时期的4个活性污泥样品氨氧化细菌的种类和氨单加氧酶的活性，并在国内首次采用PCR-DGGE相结合的技术对样品中总的细菌类群的差异进行研究。结果表明采用PCR-DGGE技术有利于更全面地了解氨氧化细菌的类群和功能，进而改善废水处理系统的处理效果。
应用PCR-DGGE技术对城市污水化学一生物絮凝强化一级处理工艺与传统的完全混合式处理工艺反应池活性污泥样品微生物种群结构进行了对比研究，对同一反应器不同位置微生物分布以及不同工况下的微生物种群结构进行了初步探讨。结果表明两种城市污水处理工艺中微生物种群多样性都相当丰富，但是种群结构相差很大。说明化学生物絮凝处理工艺的微生物作用与成分相近的城市污水处理工艺中微生物作用机理可能存在相当大的差别。
R0wan等采用生物滴滤反应器和生物滤池处理同种废水，运用PCR-DGGE考察了不同反应器中的氨氧化细菌菌群的组成。虽然不同形式反应器或是同一反应器的不同位置中的氨氧化细菌菌群组成不同，但是主要种群是不依赖反应器的形式或是在反应器中所处的位置不同而改变的，也正是这些主要种群在整个处理过程中发挥着重要的作用。
采用PcR-DGGE技术对处理采油废水的水解酸化一缺氧法不同生物反应器中污泥样品进行研究，确定了微生物的优势菌种，并进行了多样性分析，结果显示了在不同环境条件下微生物群落结构的连续动态变化过程。
1．2 在废气生物处理研究中的应用
生物过滤是一种能有效处理恶臭和挥发性有机废气的气体污染控制技术。生物滤池和生物滤塔作为生物处理恶臭气体的简单有效的方法，得到了快速的发展。
采用PCR-DGGE技术研究除臭生物滤池中试装置中分别一处于较强酸性和中性的两种不同运行环境下微生物种群的多样性和生物种群的结构变化。通过扩增细菌16SrRNA基因的V3可变区，结合应用DGGE技术分析除臭生物滤池的生物种群的结构变化，并回收主要的DN段，结合PCR测序及T载体克隆测序，明确优势菌群的系统发育地位。结果表明，除臭生物滤池在不同的口H条件下，微生物的多样性及其丰度存在较大差别，强酸性对微生物具有较高的选择作用，与中性条件相比 微生物种群多样性相对较低。同时在滤池的不同层次上也表现出明显的空间分布多样性差异，序列比对结果显示硫氧化细菌在除臭过程中占有优势地位。为更好地处理恶臭气体提供可靠的科学依据，同时也为生物除臭的应用提供一定的理论基础。
生物滤塔中微生物的种群结构以及微生物多样性对于恶臭气体的处理效率以及反应器的稳定运行至关重要。殷峻等应用DGGE技术对处理含氨废气的生物滤塔中微生物多样性随时间的变化进行了研究，通过比较反应器不同填料、不同时期微生物多样性得出结论：填料中微生物的多样性都随着反应器运行时间的延长而有所减少；与污泥填料和混合填料相比，堆肥填料的微生物多样性程度最高，反应器的去除能力也最好。
1．3 在污泥生物处理研究中的应用
在污泥处理过程中，污泥的稳定化是…个相当重要的过程。微生物的稳定化过程对于系统达到稳定状态具有更直接的指导意义。傅以钢等用DGGE指纹图谱技术对污泥堆肥工艺中的细菌种群动态变化及多样性进行了研究。结果表明，生物法污泥堆肥周期小于8d。对污泥堆肥各工艺环节样品进行DGGE指纹图谱和相似性系数Cs值分析，发现随着反应的持续进行，微生态结构的Cs值越来越高，说明微生物种群结构愈趋稳定。证实污泥微生态能迅速进行优胜劣汰的筛选，调整内部细菌种群结构，从而达至 适应环境的目的，在发酵过程中形成的优势细菌种群能长时间保持稳定。
中图分类号 X172 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2017）13-0036-03
Study on Soil Microbial Diversity in Heavy Metal Contaminated Soil
Li Yan1 et al.
（1Anhui Huajing Resources and Environment Technology Co.，Ltd.，Hefei 230094，China）
Abstract：In this paper，the research methods of microbial diversity of heavy metal contaminated soils in recent years are summarized，and their advantages and disadvantages and their application are analyzed. The research methods of microbes are also discussed.
Key words：Heavy metal pollution；Soil microbes；Microbial diversity；Research methods
近年来，由于农药、化肥的大量使用，以及冶金、采矿业的迅猛发展，土壤重金属污染日趋严重[1]。重金属污染不仅会严重影响农产品以及农作物的品质，而且会通过食物链进入人体，危害人体健康。土壤是微生物栖息的最重要环境之一，提供了微生物生长所必要的营养物质。土壤微生物种类十分丰富，主要分为细菌、真菌、古菌以及放线菌等。土壤微生物是土壤有机质以及土壤养分C、N、P、S等循环转化的动力，参与土壤中有机质的分解、腐殖质的形成、土壤养分的转化循环等[2]。土壤微生物在土壤生态系统中扮演者十分重要的角色[3]，对环境的变化反应灵敏[4]，其群落多样性和相对组成，是评价环境质量的重要参数[5]。一旦土壤生态系统受到污染，土壤微生物就会发生相应的变化[6]。有研究报告指出，土壤重金属污染能明显影响土壤微生物的活性及结构[7]，李晶等[8]研究也表明，土壤微生物对重金属胁迫特别敏感，可通过微生物群落结构的变化来反映土壤质量和健康状况[9]。因此，研究土壤微生物具有十分重要的意义。本文对研究微生物传统以及各种新型研究方法进行了分类介绍，并对各种方法的优缺点以及适用场合进行说明。
1 土壤微生物研究方法
1.1 传统的分离纯培养和稀释平板计数 在固体琼脂培养基上接种培养微生物，可利用微生物的表面特征差异，在固体培养基上对微生物进行分离纯化，也可利用该方法对微生物在平板上进行简单的计数[10]。同时可以通过配制不同成分的培养基对微生物进行筛选驯化，从而得到我们需要的菌种。此种方法的优点是成本低，便于对微生物的状况做出初步的判断。缺点是由于自然界中存在大量的不可培养的微生物，且存在很多对温度要求苛刻并微生物，如嗜低温菌和嗜高温菌，传统的固体培养基的培养温度并不能满足这些微生物的生存所需温度。
1.2 Biolog微平板法 Biolog微平板原理是基于测定微生物对单一碳源利用程度的差异来表征微生物的生理特性[11]。Biolog微平板由对照孔和95种不同单一碳源孔组成并在其中添加染料，当接种纯培养的菌液时，其中一些孔的营养物质被利用，使各孔呈现出不同的颜色，从而形成微生物特有的代谢指纹，可通过与标准菌种的数据库做对比，从而可鉴定出被测菌种。与传统培养方法相比，此方法可以估算微生物群落代谢多样性和功能多样性。同时可根据各孔的颜色差异来反映出微生物群落的均匀度，从而可以反映出群落的稳定性[12]。该方法的缺点是当环境差异不大时，这些指数并不能较敏感地区分菌群之间的差异[13]。同时由于不同的生长和竞争的结果，菌种之间会相互影响导致种群发生变化，影响测定结果[14]。
1.3 磷酸脂肪酸分析法（PLFA） 磷酸脂肪酸存在于活细胞的细胞膜中，具有属的特异性，不同属的微生物通过不同生化途径而形成不同的磷酸脂肪酸（PLFAs）[15]。因此，土壤中的PLFAs组成和含量变化在一定程度上可反映土壤中微生物量和群落的动态变化。通过对微生物的磷酸脂肪酸进行提取，并依据其中的特征脂肪酸指示的微生物种类[16]，可对土壤中微生物群落特征进行表征。此种方法具有对试验条件要求低、无需对微生物进行培养、测试功能多和稳定性好等优点[17]。但PLFA法也具有一定的局限性。该方法只能鉴定到属，PLFA图谱并不能给出一个实际的微生物种类组成，仅能反映微生物群落的概图[18]；另外，该方法容易受微生物生理状态影响[19-20]；古菌不能使用PLFA图谱进行分析，因为它的极性脂质是以醚而不是以酯键的形式出现[21]。同时由于目前尚未建立土样中所有微生物的特征脂肪酸，并且在很多情况下，还无法确定土样中某些脂肪酸与特定微生物或微生物群落的对应关系[22]。
1.4 变性梯度凝胶电泳技术（PCR-DGGE） 该技术是以复杂的环境样品如土壤为研究对象，直接提取微生物DNA，利用通用引物进一步对提取的DNA进行PCR扩增。将扩增产物开展DGGE凝胶电泳分析[23]。DGGE不是将分子量不同的DNA分开，而是通过聚丙烯酰胺凝胶中变性剂浓度梯度的不同，将序列不同的DNA分开[24]。该方法的原理是根据DNA的解链特性，不同碱基组成的DNA双螺旋发生变性所需要的变性剂浓度不同。在普通的聚丙烯酰胺凝胶基础上加入变性剂，根据其迁移行为决定于其分子大小和电荷的原理能够将长度相同但序列不同的DN段区分开[25]。该方法具有可靠性高、重现性强、方便快捷、分辨率高等优点[26]，但同时也存在一定的局限性。DGGE还不能全面分析土壤中全部微生物，该方法只能检测出土壤中相对丰度大于1%的微生物[27]；同时DGGE对实验要求较高，凝胶浓度、温度、电压等电泳条件选择不当时，就会发生共迁现象[26]，即同一条带不止包含一种微生物，微生物的种类被低估。
1.5 高通量测序技术 高通量测序技术也称“下一代”测序技术，1次并行能对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定。以Illumina公司的Solexa，ABI公司的SOLiD，和Roche公司的454技术为代表[28-29]。该技术对于研究土壤微生物具有极大的意义。该技术极大地降低了微生物测序成本，实验了大规模土壤微生物直接测序[30]；同时该方法极大地提高了测序通量，丰富了研究的信息量，便于研究者更加深入地了解所研究课题。但同时该方法也存在一定的局限性，主要局限性如下：海量数据分析难的问题，该测序方法所测数据之深，所获信息之大，都极大地加大了实验研究者分析数据的难度；数据去伪存真难的问题，在土壤微生物高通量测序中，存在物种丰富度被高估的情况[30]，对高通量测序结果去伪存真，探索新的统计学方法成为研究者面临的一大难题[31]。
1.6 基因芯片技术（GeoChip） 基因芯片（GeoChip）是研究土壤微生物非常有效的技术手段，作为新一代的核酸杂交技术，可用于检测环境微生物参与物质循环、污染物降解等过程中参与的功能基因[32]。该方法是在芯片上含有编码各种与生态学和生物功能过程或生物降解作用有关酶的基因[33]。由此可见，功能基因芯片为土壤微生物研究提供了全新有力的技术分析工具，有利于更加有效地利用微生物对污染土壤进行修复[34]。基因芯片技术具有高密度、高灵敏度、自动化和低背景水平等显著优点[35]。但是任何技术都存在一定的局限性，基因芯片技术也不例外。该技术虽能检测出微生物在生物学过程中所发挥作用的功能基因，但是却不能直接表征微生物的群落多样性组成和丰富度。应结合DNA与mRNA测序，可以更加真实全面地反映土壤微生物群落结构信息及其生理活动[34]。同时该方法在取样、标记、杂交条件、图像处理、数据归一化以及所得数据的质量评估等都会带来很多误差[36]。
2 不同方法在重金属污染土壤中的应用
刘云国等[37]在湖南临乡桃林矿区土壤中采用稀释涂布法在马丁固体培养基上筛选出一株高抗铜、锌菌株；张秀等[38]利用Biolog微平板法来分析生物质炭对镉污染土壤微生物多样性的影响；孙婷婷等[39]利用磷酸脂肪酸分析法来分析羟基磷灰石-植物联合修复对Cu/Cd污染植物根际土壤微生物群落的影响；郑涵等[40]利用PCR-DGGE分析方法对锌胁迫对土壤中微生物群落变化的影响进行了评价分析；江玉梅等[41]利用Illumina平台高通量测序技术分析重金属污染对鄱阳湖底泥微生物群落结构的影响；路桃香对植物非根际土壤微生物进行454高通量测序。
目前对于微生物研究方法有很多种，有最先进的技术，也有传统的实验方法，每种方法都各有优缺点，因此，在研究土壤微生物时，应结合土壤特征以及研究目的合理选择研究方法。如条件允许的情况下，可以结合多种技术方法同时使用，可以更好地研究土壤微生物的群落特征。
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中图分类号：Q938.1+1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）06-1443-04
土壤微生物是森林生态系统中最重要的组分，在凋落物分解、腐殖质合成以及养分循环等过程中起着十分重要的作用。其种类和组成不仅直接影响土壤的生物化学循环，而且是土壤生物活性的具体体现，并在森林生态系统的物质循环和能量流动中扮演着重要角色[1-3]。不同土壤分布着不同的土壤微生物，而不同的微生物多样性又影响土壤功能的多样性[4]。土壤微生物的组成和分布可以在深层次上揭示森林生态系统的物质循环和能量流动。目前测定土壤微生物多样性的方法主要有稀释平板法、磷脂脂肪酸分析（PFLA）法、Biolog微平板分析法及分子生物学方法等[5]。随着分子生物学技术在土壤微生物研究中的不断发展，土壤微生物多样性的研究有了新的突破。核糖体ITS区为非编码区，受到的选择压力较小，进化速度快。因此该区段能够提供比较丰富的变异位点和信息位点，目前已经用于种间、亚种和种群水平上的遗传多样性研究[6]。自从Innis等[7]1990年首先设计ITS引物对真菌核内核糖体RNA基因进行扩增以来，ITS序列分析技术在真菌分类、鉴定的研究中应用越来越广泛。
该研究利用分子生物学技术对长白山自然保护区不同森林类型的土壤真菌群落组成进行分析，比较不同植被类型与土壤真菌之间的关系及变化趋势，以期加深对土壤真菌变化过程和机制的认识，为长白山区域天然林保护和生态建设提供基础资料。
1 材料与方法
1.1 材料
土壤样品于2010年10月采自长白山自然保护区（表1）。按不同林型采用对角线型混合取样法采集表层的土壤，采集深度为0～5 cm，用塑料袋封装带回。-80 ℃下密封保存。
1.2 试剂与仪器
Taq DNA 聚合酶、dNTPs、限制性内切酶Hinf Ⅰ购自宝生物工程（大连）有限公司；土壤真菌基因组提取试剂盒购自MoBio Laboratories公司；DNA纯化试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。Gene-9700型PCR扩增仪、上海卢湘仪台式离心机、BIO-RAD凝胶成像系统等。
1.3 方法
1.3.1 土壤样品DNA的提取与检测 土壤样品DNA的提取参照MoBio土壤真菌提取试剂盒的方法。
1.3.2 ITS-PCR扩增及产物纯化 用于ITS片段扩增的引物采用真菌ITS区通用引物ITS1-F和ITS4，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，具体序列如下：ITS1-F（5′3′）：CTTGGTCATTTAGAGG
AAGTAA；ITS4（5′3′）：TCCTCCGCTTATTGATAGC。
ITS扩增反应体系为：5 μL 10×PCR Buffer（50 mmol/L KCl；10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.3；1.5 mmol/L MgCl2）、2 μL DNA模板、ITS1-F和ITS4（10 μmol/L）各2.5 μL、4 μL dNTPs（2.5 mmol/L）、0.5 μL Taq DNA聚合酶（5 U/μL），加ddH2O至50 μL。反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性60 s，52 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，共35个循环；最后72 ℃延伸8 min。取5 μL ITS-PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后用凝胶成像处理系统观察拍照。
1.3.3 ITS-PCR产物的纯化 采用DNA纯化试剂盒，按照说明书进行PCR产物纯化。
1.3.4 ITS-PCR产物的限制性酶切分析 ITS-PCR产物的T-RFLP分析反应体系为30 μL：含10 μL ITS-PCR产物、2 μL Hinf I（10 U/μL）、3 μL 10× Buffer、加ddH2O至30 μL。置于37 ℃水浴中酶切反应4 h，然后65 ℃作用20 min终止反应。将酶切产物送至上海美吉生物医药有限公司测序。
1.3.5 数据分析 每个T-RFLP的丰度百分比（Ap，%）按照公式Ap=ni/N×100%计算， 其中ni代表每个可分辨的T-RFLP的峰面积， N代表所有T-RFLP峰面积的总和。种群多样性指数[8]用BIO-DAP软件计算。依据公式Cs=2N（A+B）/（NA+NB）计算样品之间Sorenson[9，10]的相似系数， 其中NA+B指两样品共有的条带数目，NA、NB指两样品各自包含的条带数目。
2 结果与分析
2.1 不同森林类型土壤真菌T-RFLP分析结果
利用限制性内切酶Hinf Ⅰ对6种不同森林类型土壤真菌ITS区进行酶切，T-RFLP分析结果见图1。从图1可以看出，酶切谱带清晰，RFLPs比较明显，酶切片段在100～600 bp之间，不同森林类型真菌群落存在明显差异。
2.2 不同森林类型土壤真菌多样性
不同森林类型土壤真菌香农多样性指数、均匀度见表2。由表2可知，1号样点的香农多样性指数最高，3号样点的最低；1、2、3、5号样点的均匀度高，4号样点的均匀度最低。一般而言，多样性越高群落稳定性大，稳定性的大小反映了多样性的大小。植物根系可为微生物栖息提供很好的场所，植被覆盖使得土壤湿度更适合于群落的发展，微生物群落的发展反过来又有利于植物群落的发展。
2.3 不同森林类型土壤真菌相似性
从不同森林类型土壤真菌群落结构相似性系数分析结果见表3。由于森林类型的不同，土壤的真菌群落也有较大差异，群落功能也有较大差异，甚至森林类型接近的土壤，真菌的相似性也比较低，森林土壤真菌的空间差异性很大。
3 小结与讨论
3.1 土壤样品DNA的提取与纯化
如何获得高质量的土壤样品总DNA是分子生物学技术的基础和关键[11]，只有获得高质量的土壤样品总DNA才能保证后续PCR扩增的准确、可靠。土样中主要污染物为多糖、腐殖酸和酚类化合物，其中腐殖酸的理化性质与核酸相似，因此在DNA提取过程中很难完全去除，而腐殖酸等杂质会影响后续的PCR反应[12]。
3.2 土壤真菌多样性指数
香农多样性指数是一种评价不同土壤的微生物群落多样性十分有效的方法，香农多样性指数越高表明微生物群落多样性越大，它由种类的丰富度及种类的均匀度两部分组成[13，14]。在不同类型的森林土壤中，真菌的群落香农多样性指数呈现出较大的差异性和复杂性，这可能是由于天然森林中的真菌的空间异质性高所致。白桦林中后期和过熟阔叶红松林，光照充足， 干扰少， 土壤结构比较稳定， 枯枝落叶积累多， 水分涵养好， 适合微生物生长， 所以土壤真菌的类群多，土壤相对较肥沃。从整体上来看， 白桦林中后期和阔叶红松林土壤质量高， 微生物种类多，土壤结构稳定，有利于植物的生长。
该研究对不同森林类型土壤真菌群落的变化规律进行研究， 探讨了真菌群落的演替规律， 但对于真菌群落的变化规律以及微生物与植物之间如何互作还需进一步研究。同时对于其他样点的森林类型土壤微生物群落的变化规律如何还有待进一步揭示。
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中图分类号：S154.3 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2012）23-5253-06
Advances of Total DNA Extraction Technology for Soil Microbial Diversity Research
XIAO Bin，JIANG Dai-hua，LIU Li-long，LIU Quan-dong
（College of Agronomy，Guangxi University，Nanning 530005，China）
Abstract： The influencing factors and application aspects， as well as the potentials and limitations of DNA extraction techniques for microbial diversity analysis were reviewed. Applying appropriate methods to extract microorganism DNA fragment that have right purity and appropriate size from soil were the precondition in soil microbial study on the molecular level， and the subsequent molecular biotechnology operations were all rely on these methods.
Key words： soil microorganism； diversity； DNA； extraction method
土壤微生物多样性是生物多样性研究的一个重要领域，是指其在遗传、种类、结构与生态功能方面的变化，对指示土壤微生物群落的稳定性，在保持土壤质量和生态系统稳定性等方面具有重要意义[1]，是当今国内外关注和研究的热点问题之一。
长期以来，由于研究方法的限制，传统的分离纯化培养技术仅能获得土壤中微生物总种群数的1%左右，而绝大部分微生物目前还不能获得纯培养[2]，未能获得纯培养的微生物才是土壤微生物的主体，因此，有关微生物多样性研究进展不大。
近年来，随着分子生物学技术的发展和研究手段的更新，基于土壤微生物群落总DNA的现代微生物分子生态学研究方法避免了传统分离培养方法的缺点，被广泛应用于土壤微生物群落结构、功能以及动态监测研究[3]。因此作为微生物群落分子分析方法的基础，最重要的一步就是从土壤样品中尽量毫无偏差地提取出高质量的、具有代表性的微生物总基因组DNA。关于土壤微生物DNA提取方法的报道很多[4，5]，然而这些方法主要侧重于土壤中的细菌群落，很少关注土壤中真菌群落总基因组DNA的提取方法及其提取效果。另外，细胞裂解不完全、DNA分子吸附在样品基质颗粒的表面、从样品中同时提取了某些重要酶的活性抑制剂、DNA分子的损耗、降解和破坏等因素也影响着土壤微生物DNA提取的质量，因而提取土壤微生物总DNA在研究中尤为重要[6]。本文主要对DNA提取过程中的主要影响因素、现行各方法的优缺点以及存在的问题作一综述。
1 基于DNA方法的土壤微生物多样性研究现状
传统微生物学研究方法主要依赖于纯培养技术和显微镜技术，对土壤微生物多样性的描述与研究存在一定的局限性。20世纪中后期，随着土壤微生物多样性研究向多方面发展，人们尝试着利用分析微生物细胞中某种指示成分，如磷脂脂肪酸（PLFA）来研究土壤微生物的种群组成，但是这些方法的缺陷是无法保证细胞中某种指示成分在土壤中的稳定性，并且如果某种微生物的PLFA是未知的，则该不可培养微生物仍难以鉴别[7，8]。
1980年，Torsvik等[9]首次建立了从土壤样品中直接提取细菌DNA的方法，并于1990年将其成功应用于DNA杂交技术，研究发现1 g土壤中有4 000个以上不同的细菌种类，说明土壤中微生物多样性是极其丰富的。后来研究者发现16S rDNA在原核微生物中普遍存在，并且含有相对保守和可变区域，在不同的个体间16S rDNA基因序列也不会进行基因交换，因此，每一种生物都有自己的独特序列。1986年，Pace[3]第一次以16S rDNA为基础确定环境样品中的微生物，使人们对大量不可培养微生物群体有了全新的认识。此后，基于16S rDNA基因的指纹图谱分析的现代分子生物学技术得到迅速发展，包括限制性片段长度多态性分析（RFLP）、随机扩增DNA多态性分析（RAPD）、单链构象多态性分析（SSCP）、基因芯片（Microarray）、PCR-DGGE/TGGE 等，为全面揭示土壤微生物种群结构和遗传多样性提供了重要手段。其总的技术路线：分离微生物基因组DNA，用特异性引物扩增16S rRNA基因片段，再将该PCR扩增产物进行更深一步分析，从而可在种、属的水平上研究不同生境中的微生物种群结构及其动态变化[10]。
2 土壤微生物总DNA的提取
从土壤样品中提取DNA的方法大致可分为2类，即间接提取法和直接提取法。间接提取法首先是对土壤样品进行反复悬浮和离心，去除土壤等杂质，提取土壤微生物细胞，再采用酶裂解细胞提取微生物总DNA。直接裂解法是不去除土壤等杂质，而是通过物理的、化学的、酶解等手段相结合，直接裂解土壤中的微生物细胞，使其释放DNA，再进行提取和纯化。但不论采用何种方法，都存在一定的缺陷，要想提取较完整的DNA需要具备以下几个条件： ①土壤微生物能从土壤中充分释放，尤其是那些紧紧吸附在土壤颗粒，甚至深藏于土壤微穴中的细菌等相对比较难分离的微生物。②对一些比较顽固的微生物，如革兰氏阳性菌、孢子和小细菌的裂解，需要更剧烈的处理，而这又会造成对裂解敏感的细菌DNA折断。③采集土壤样品后应尽快提取DNA，因为土壤在4 ℃储藏几周就会造成大分子DNA的降解。
2.1 间接提取土壤微生物总DNA
Torsvik等[11]最先报道了从土壤中提取微生物DNA的间接法，包括以下4个步骤：①分散土壤；②土壤微生物的提取（分离细胞与土壤）；③土壤微生物的纯化；④细胞裂解及DNA纯化。
2.1.1 土壤分散 土壤微生物一般与土壤颗粒结合，包藏在土壤团聚体内，因此，最大限度地分散土壤是从土壤中分离提取微生物的关键。通常采用物理或化学法，或是二者相结合以达到微生物与土粒分离的目的。常用的物理分散技术是使用玻璃珠与土壤悬液一起振荡，或是使用韦林氏搅拌器（匀浆器、转子混合器）搅拌分散，或是使用超声波分散土壤团聚体等。而化学分散法是通过加入化学分散剂以达到促进微生物与土粒分离的目的。最常用的分散剂为0.2%焦磷酸钠，其他还有Winogradsky盐溶液、Tris缓冲液、生理盐水、六偏磷酸钠、胆酸钠、脱氧胆酸钠、纯水等[26]。值得注意的是，为有效地分散土壤，分散剂的种类、浓度、加入量、机械作用（振荡、搅拌和超声波等）的方式、时间以及容器的大小等均应加以考虑。还可以将化学试剂与机械方法结合来悬浮土壤颗粒。研究发现Chelex100就是一种有效的土壤颗粒悬浮剂。各种分散方法分散效果不同，采用何种分散方法效果最佳目前尚无一致结论，而且防止细胞因物理、化学作用导致破裂提前释放DNA很重要，处理不当会使DNA降解。常用分离提取土壤微生物的土壤分散方法列入表1。
2.1.2 土壤微生物的提取 土壤微生物的提取通常采用离心分离法，既要使微生物与土壤颗粒分离，又要保证基本不破坏微生物细胞。由于土壤中细菌的平均密度（1.1 μg/cm3）远小于土壤矿物质的平均密度（2.6 μg/cm3），因此采用离心或淘选法可使细菌与土壤颗粒得到较好的分离。Hopkins等[17]采用密度逐级离心法分离出60%以上的土壤细菌。此外，也有学者提出用过滤法，即将土壤样品分散处理后，经20 μm或30 μm微孔筛真空抽滤，其滤液中即可能含有绝大多数土壤细菌，此过程操作简便，提取液中土壤残留物少，易于纯化。
由于土壤中的真菌、放线菌主要以菌丝的形态与土壤颗粒缠绕在一起以及细胞壁结构的特殊性，从土壤样品中分离提取真菌放线菌要比提取单细胞的细菌相对困难。迄今为止，国内外有关分离提取真菌的研究文献极少，且这些报道方法所提取的真菌菌丝只占真菌总生物量的极少部分。Vilarino等[21]在前人研究的基础上提出了分离土壤真菌的原理：新鲜土壤经分散后，土壤悬浮液中的菌丝可附着在慢速转动的铜丝（直径150 μm）框上，洗脱后即得提取的土壤真菌。潘力等[22]以曲霉菌为例，采用微波处理菌丝并置于10× TE Buffer中即可得到DNA，建立了一种快速提取丝状真菌DNA的实验方法，为高通量快速筛选丝状真菌转化子奠定了基础。吴敏娜等[23]以传统土壤总DNA提取方法及纯菌DNA提取方法为基础，分别与蜗牛酶、纤维素酶进行组合、优化，得到7种不同的土壤真菌基因组DNA提取方法。分离提取土壤细菌和真菌的流程如图1所示。
2.1.3 土壤微生物的纯化 目前常用两相分离技术对上述土壤微生物提取液进行纯化。两相分离技术最早为德国化学家Albertsson于20世纪50年代所建立，当时主要用于生物大分子的分离。近些年该技术广泛应用于生物化学、细胞生物学和生物工程等领域，是一种分离、纯化生物大分子、细胞、病毒的方法，该技术也逐步发展成为一种温和的生物分离方法，相对于原始的纯化手段具有过程简单、纯化时间较短等特点，应用领域广泛[24]。关于其分离机制目前尚不完全清楚，有人认为其分离的原理主要取决于不同组分的亲水性差异，也有人认为还与不同组分的电荷性质差异有关。当两种互不相溶的聚合物以一定浓度溶于水中时，便可形成体积不同的两相，被分离组分由于其与两相的亲和力不同，分别进入不同相从而达到分离的目的。目前应用最为广泛的是PEG（聚乙二醇）/Dextran（葡聚糖）系统和PEG/无机盐（磷酸盐或硫酸盐）系统。对于不同的两相组分，分离时间不尽相同[25]。Smith等[19]研究了应用两相分离技术从土壤中分离纯化非菌丝体微生物的效果，发现经充分混合静置一定时间后，即可形成上下两层体积比约为4∶1的两相分离系统，其中细菌主要富集在上层PEG相，土壤残存颗粒将进入下层Dextran相，经4次提取纯化，富集在上层PEG相的细菌总量约达加入两相分离系统细菌总量的60%，而上层PEG相中的土壤矿质颗粒总量仅占总加入量的4%以下。李妍等[26]用2%PEG+6%Dextran两相分离技术（A2PP）纯化细菌，测定细菌生物量，研究两相分离技术在土壤微生物研究领域的可应用性，结果表明采用0.1%胆酸钠、钠型离子交换树脂、玻璃珠与土壤一起在4 ℃下振荡2 h，能较好地分散、纯化土壤细菌。研究表明，两相分离技术同样有可能用于分离纯化土壤真菌。
2.2 直接提取土壤微生物总DNA
现今的土壤细菌DNA直接提取法是在Ogram等[27]建立的方法基础上发展起来的，主要包括两个步骤：①原位细胞裂解；②DNA提取和纯化。
2.2.1 原位细胞裂解 直接裂解土壤微生物细胞的方法包括：机械破碎法、化学法、酶解法及3种手段相结合。机械破碎法常用的有冻融法、微波、超声波法和玻璃微珠震荡法；化学法常用表面活性剂SDS和SarkosyI、热酚、高盐、异硫氰酸胍等；酶解法：裂解酶、溶菌酶、蛋白酶K、链霉蛋白酶等。其中溶菌酶不仅可处理革兰氏阳性菌细胞壁，还可水解糖苷键和腐殖酸。2种或多种方法相结合对DNA的提取效果较好。王啸波等[28]采用PBS缓冲液洗涤土壤样品，结合SDS裂解微生物细胞的方法，同时提取2种土壤样品的微生物DNA和RNA，结果表明该法提取的核酸不需要进一步处理，其纯度就可以满足后续的分子生物学试验，从而避免了由于纯化导致的核酸量的降低。熊开容等[29]采用冻融+玻璃珠+溶菌酶+SDS方法提取了活性污泥中微生物DNA，结果表明获得的DNA适合于酶解和PCR扩增要求。
值得关注的是，土壤中微生物种类繁多，生理状态不同，革兰氏阳性和阴性细菌以及细菌与真菌的细胞壁结构和组成亦不相同。为了使提取的DNA具有代表性，就必须保证土壤样品中所有微生物细胞裂解释放出核酸，因此必须根据试验的性质、要求选择适当裂解方法。研究表明，基于SDS的高盐提取法会对一些革兰氏阳性细菌效果不好。张瑞福等[30]采用冻融+溶菌酶+SDS方法提取3种芽孢杆菌（G+）DNA，结果表明经冻融处理的霉状芽孢杆菌均提取到了DNA，未经冻融处理的霉状芽孢杆菌未提取到DNA，且冻融处理未对DNA造成大的剪切，提取的DN段还大于23.1 kb。张颖慧等[31]使用优化的CTAB法提取真菌基因组DNA。使用液氮冻融以及玻璃珠振荡的方法代替了传统的液氮研磨，实验结果表明该方法所需菌体量少，且得到的基因组DNA比用传统的CTAB法得到的基因组DNA产率高、纯度好且步骤简单，适用于一次微量提取多个样品的基因组DNA，可用于大部分分子生物学基本实验如PCR和DNA的酶切等。
2.2.2 DNA提取和纯化 在已报道的DNA提取和纯化方法中，通常采用饱和酚或氯仿和蛋白酶处理，去除DNA样品中的蛋白质和部分RNA，然后对DNA进行抽提，再用乙醇、异丙醇或聚乙二醇（PEG）沉淀后，经羟基磷灰石柱或氯化铯密度梯度超速离心等进一步纯化。其他纯化方法有聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）法、色谱法、电泳法、透析和过滤法、试剂盒法等。
Lamontagne等[32]研究结果表明PVP能够与腐殖酸结合，起到有效去除提取的DNA中腐殖酸杂质、提高DNA纯度的作用。李靖宇等[33]采用氯化钙-SDS-酶法对湿地土壤微生物DNA进行提取，结果表明该方法能高效去除湿地土壤腐殖酸，纯度较高，能直接满足PCR扩增。李钧敏等[34]用含PVPP的缓冲液预洗DNA样品，然后添加CaCl2和牛血清白蛋白可去除其中的腐殖酸，用PEG8000沉淀DNA，可提高DNA质量，并证实这是一种简便有效可直接应用于PCR分析的土壤微生物总DNA的提取方法。蔡刘体等[35]采用 SDS-CTAB法提取烟草病圃土壤微生物总DNA，该方法既可达到裂解效果，还有助于去除腐殖酸，有利于提高所提取DNA 的质量。吴红萍等[36]采用酚氯仿和柱式腐殖酸去除剂对粗提取的土壤微生物DNA进行纯化后，可用于PCR扩增，并以细菌16S rDNA基因引物可扩增到相应的片段。朱立成等[37]采用直接法提取土壤微生物总DNA，然后用Sephadex G-200凝胶离心层析法纯化，可得到纯度较高的DNA。段学军等[38]采用稀释模板及巢式PCR法很好地解决了在DNA提取纯化过程中不能完全去除腐殖质的问题。滕应等[39]将BIO101 Systems公司研制的FastPrep多试管核酸提取系统与相应的Fast DNA SPINKit for Soil试剂盒联用，有效地提取了重金属复合污染的农田土壤微生物总DNA。
没有哪种单一的纯化步骤可以除去所有污染物，故许多研究者已经将几种纯化步骤结合起来以期获得最好的纯化效果。Smalla等[40]将粗提的DNA进行3步纯化：①氯化铯密度梯度超速离心纯化；②醋酸钾沉淀；③Geneclean纯化。发现经前2步纯化的DNA通过稀释即可部分被限制性酶切和扩增，但如不经稀释而进行限制酶切和扩增，则必需进行最后一步纯化。
2.2.3 直接法和间接法的比较 研究表明，直接法获得的DNA较多，但不易去除抑制剂，间接法提取的DNA只占直接法的1/10，但分离的DNA纯度较高，而且间接法得到的细菌量只占总菌群的25%～50%，直接法提得的DNA却可以超过细菌总DNA的60%。因此，要想获得大量DNA，选择直接法较好，当所需DNA量不大，而且要排除真核或胞外DNA污染时，可用间接提取法。
直接提取对某些特定样品用特定的操作方法能获得较高的提取效率，但是对有些生物量不高的样品则很难得到足够的环境总DNA用于后续操作，适合在样品生物量较大但采样量不大的情况下采用。间接提取在提取效率上远小于直接提取，但用间接提取法所得到的环境总DNA纯度较高，所有样品能直接用于PCR扩增，并且能更好地体现样品中微生物的多样性，适用于有大量样品的情况。
2.3 DNA的纯度和浓度测定
DNA在260 nm处有吸收峰，腐殖酸在230 nm处有吸收峰，计算OD230/OD260（腐殖酸/DNA）的比值可以确定所提DNA中腐殖酸的污染程度。一般情况下OD230/OD260比值应在0.4～0.5之间为好， OD230/OD260比值越高，腐殖酸污染越严重。蛋白质在280 nm处有吸收峰，因此OD260/OD280比值经常被用来指示DNA中蛋白质的污染程度，当OD260/OD280比值为1.8～2.2时，DNA较纯，当受蛋白质或其他杂质污染时，OD260/OD280值则较低[41]。此外，还可采用PCR扩增检测DNA的纯化质量，所用扩增引物见文献[42]。
提取的DNA浓度也可根据测定的OD260值计算，根据公式[dsDNA]=50×OD260×稀释倍数，计算DNA的浓度（μg/mL），换算出每克干土提取DNA的量[43]；还可采用DyNA Quant 200荧光仪对纯化后DNA的浓度进行测定[28]。
3 影响土壤微生物总DNA提取的因子
土壤成分复杂，含有大量的有机及无机等多种生物活性抑制物，如腐殖酸、多酚类化合物、重金属等，它们的存在可能影响土壤DNA的提取质量，抑制DNA聚合酶的活性从而影响土壤微生物多样性的分析。研究发现，腐殖酸是土壤DNA提取过程中极难去除的污染物，由于它的分子大小和理化性质与DNA相似，过分注重腐殖酸的去除，势必会造成DNA的大量损失，因此腐殖酸的有效去除是土壤DNA提取的难点所在。
各种土壤类型、质地和成分的差异，都会影响土壤微生物DNA的提取效果。Zhou等[44]用SDS-CTAB法从8种土壤（包括沃土、沙沃土和沙黏土，其中黏土含量为5%～31%不等）中提取DNA，平均获得DNA的量为0.5～26.9 μg/g，并发现获得的DNA量与土壤的有机磷含量有明显的正相关关系。另外，研究也发现，土壤中细菌的裂解效率与其中黏粒的含量呈明显的负相关。土壤中各粒级颗粒对细菌的吸附量从大到小的顺序为：黏粒、粉粒、细沙粒、粗沙粒，其中黏粒是粉粒的3.7～4.9倍、细沙粒的44.3～89.2倍、粗沙粒的262.0～799.0倍，细菌在粒径不同的土壤颗粒表面的最大与最小吸附量分别相差389.0和857.0倍，去有机质土壤颗粒对细菌吸附亲和力较含有机质土壤颗粒的大[45]。因此，不同的土壤适合于不同的DNA提取方法，在土壤DNA提取过程中，应针对土壤类别选取合适的提取方法，以便进行后续研究。
4 小结
从土壤微生物群体基因组的角度研究其多样性及功能是可行的方法，并受到广泛的关注[46]。因而越过分离培养的步骤，直接从土壤中获得总DNA以分析土壤微生态群落结构，关键是如何尽可能全面地提取土壤中微生物的总DNA。土壤本身成分复杂，有许多物质难以预料，对提取较好质量的DNA提出了很高的要求。因此建立一种简单有效的提取方法显得非常重要。
间接法提取的微生物DNA纯度较高，提取的种类和数量较少；直接提取法直接在土壤中裂解细胞，使其中内含物尽可能地释放，能够代表大部分的土壤微生物，但土壤中所含物质种类较复杂，所以提取的DNA质量受到很大的影响，需要进一步纯化，而这些处理往往造成部分DNA的丧失，可能使在土壤中本身存在量较少的种类丧失或检测不到，影响到土壤微生物多样性的分析。最近，Milko等[47]发现一种Taq DNA聚合酶基因突变型可增加对腐殖酸等PCR抑制物的抗性，不需要对基因组DNA进行纯化就可以进行后续的分子生物学分析，因此具有广泛的应用前景。
绝大多数直接提取法提取的DN段长度不会超过23 kb，而DNA的某些用途如宏基因组文库构建，需要大片段的DNA，直接提取法对此几乎无能为力。
在DNA提取产率高即表示其所代表的微生物多样性高的前提下，DNA直接提取法被认为是较好的方法并被广泛应用[48]。但近年来有研究表明DNA提取的产率高不等同于微生物的多样性高，间接提取法又再次被提出并用于相关研究[49]。这就要求在选择提取方法时不仅要试用直接提取和间接提取这两类方法，而且在每类方法中也要试用不同的处理组合方式，以使后续操作能顺利进行，并得到准确可信的研究结果。
评价一种土壤微生物DNA提取方法是否有效，除了通常要求的提取片段无降解且比较完整外，还需要能够有效去除土壤中大量存在的影响后续实验的物质，如腐殖酸、腐殖酸似物、酚类化合物、重金属离子等；能在单位样本量中比较彻底地提取出微生物DNA；提取方法应具有普适性，对土壤中大多数微生物能够有效等[50]，且提取的DNA能更好地代表土壤微生物的真实性和异质性。
5 展望
目前，国内外对土壤微生物总DNA提取方法的报道很多，但每一种方法都存在一定的缺陷。因此，从土壤样品中提取DNA还没有通用的最佳方案，需要根据具体的土壤特点、实验室条件和实验目的而定。在提取过程中还要兼顾实验操作是否简便，方法是否经济以及样品量是否充足。另外，将现代分子生物学技术与传统微生物研究方法结合起来，才能更全面地认识和理解土壤微生物群落多样性及其相应的生态功能。
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关键词:污水治理;水源保护;生态学分析
Key words: sewage treatment;water conservation;ecological analysis
中图分类号:TU992文献标识码:A文章编号:1006-4311(2010)15-0170-01
0引言
水是人类社会生产和生活必不可少的宝贵自然资源,也是生物赖以生存的环境资源。工业革命以来,随着科技进步和社会生产力的极大提高,人类创造出前所未有的物质财富,加速推进了文明发展的进程。与此同时,人类的生产生活活动产生的污染也造成了水环境质量不断恶化和水资源危机的加剧,水环境污染与水资源短缺已演变成备受全世界关注的资源环境问题,严重地阻碍着经济的发展和人民生活质量的提高,继而威胁着人类的未来生存和发展。
1我国污水治理的技术环境
在污水治理设备方面,总体技术也落后于国际先进水平,仅为国际20世纪70-80年代的水平。这些污水治理设备仅仅可以满足一般工业废水和生活污水的处理需求。由于处理设备单机产品多,系列化程度低,成套装置生产不足,严重缺乏生产高新生物技术处理设备的能力。我国生产的用于城市污水治理的动力设备,如鼓风机、水泵等,普遍存在能耗较大的问题,造成我国城市污水治理设施的运营费用居高不下,在一定程度上也制约了我国城市污水治理产业的发展。[1]
2我国的污水治理技术
2.1 厌氧生物处理技术厌氧生物处理技术的能耗较低,可以回收生物能(如:沼气),污泥产量较低。厌氧微生物可以对好氧微生物所不能降解的有机物进行降解或部分降解;对温度、pH等环境因素要求较高。但整体来说,经厌氧生物处理的出水,水质较差,需要进一步利用好氧法进行处理,伴随气味较大,对氨氮的去除效果不理想。
2.2 好氧生物处理技术常用的好氧生物处理工艺有三大类:活性污泥法、生物膜法、膜生物反应器工艺。
①活性污泥法工艺。活性污泥法主要包括传统性污泥法污水处理技术、氧化沟技术、间歇式活性污泥处理技术(SBR,Sequencing Batch Reactor)和AB法污水处理技术。SBR法的工艺流程简单,且造价低,主体设备只有序批式间歇反应器,无需二沉池和污泥回流系统,初沉池也可省略。具有布置紧凑,占地面积小的特点,可根据水质和水量情况灵活运行,具有良好的脱氮除磷效果。[2]②生物膜法工艺。污水的生物膜处理技术既是传统的,又是发展中的污水生物处理技术。迄今为止,属于生物膜处理法的工艺有生物滤池(普通生物滤池、高负荷生物滤池、塔式生物滤池)、生物转盘、生物流化床、曝气生物滤池(BAF)、生物接触氧化、纯氧生化处理等。生物滤池是早期出现、至今仍在研究、发展中的污水生物处理技术,而后三种则是近几十年来开发的新工艺。③膜生物反应器工艺。膜生物反应器MBR是二十世纪未发展起来的新技术,它是膜分离技术和活性污泥生物技术的结合。它不同于活性污泥法,不使用沉淀池进行固液分离,而是使用中空纤维膜替代沉淀池,因此具有高效固液分离性能,同时利用膜的特性,使活性污泥不随出水流失,在生化池中形成超高浓度的活性污泥浓度,使污染物分解彻底,因此出水水质良好、稳定,出水细菌、悬浮物和浊度接近于零。生活污水处理后可直接回用,在污水处理方面具有传统工艺所不具备的优点。
2.3 污水的自然处理技术污水的自然生物处理方法主要是利用自然的生态系统如土地、湿地等,通过生态系统中的动物、植物与微生物协同作用,去除污水中污染物的一种方法。我国在“七五”期间就已经对废水土地处理技术进行了广泛的研究,解决了许多技术上的问题,“八五”期间又列入了国家攻关重点项目,这也为我国推广应用土地处理系统创造了条件。[3]
3PLFA方法分析曝气生物滤池微生物的研究
3.1 PLFA方法在水体微生物群落结构和生物多样性分析中应用在现有的关于水中微生物群落的研究中,PLFA一般只能定性的、粗略的区别革兰氏阳性、阴性、好氧细菌、厌氧细菌、放线菌、真菌等,很少能用来定性的测量指定种属的微生物。目前,只有少数几种PLFA生物标志物可以指示某些种属的细菌,如硫酸盐还原细菌等。地下水中原生动物的PLFA标志物的发现有助于了解深层含水层中微生物食物链结构和微生物的活性,在地下水的微生物修复方面具有重要意义。[4]
3.2 PLFA方法在沉积物微生物群落结构和生物多样性分析中应用江、海等沉积物的微生物区是由复杂的微生物群落组成,它能够完成主要的矿化反应,这对营养元素的循环和大部分深海食物链的形成具有重要作用。使用PLFA谱图分析方法能够获得有关沉积物中微生物生物量和群落结构的信息,沉积物样品可以不进行处理,也可以是冷冻或冻干的。PLFA法在沉积物微生物群落结构和生物多样性分析中的应用,对污水治理技术的提高有着重要的现实意义。
4结语
水是人类赖以生存的三大生命要素之一。在我国,经过几十年的改革开放,经济得到了迅猛发展,同时也带来了诸多环境问题,尤其是水污染十分突出,严重制约着社会经济和环境的可持续发展。随着我国工业、农业的迅速发展和人们生活水平的提高,水体污染现象越来越严重,直接威胁着人类的生命健康和整个生态系统的稳定性。严峻的水形势迫切要求我们必须大力进行污水处理及其资源化,同时由于我国经济水平尚不发达,更迫切需要我们研究、推广和应用处理高效、投资节省、运行低耗的污水处理新技术。
参考文献:
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记者：请您为我们介绍一下深海生态系统调查研究的意义与动态情况。
邵宗泽：深海水体、深海沉积物、深海平原、海山、海沟、冷泉等各种生境构成了深海特殊的生态系统。深海生态系统是地球上最大的生态系统，复杂独特、生境多样，蕴藏着巨大的基因资源，已引起国际社会高度关注。
与地球上其他生态系统相比，对深海生态系统的调查研究还很少。虽然早在1977年，美国“阿尔文”号深潜器就发现了深海热液区，但目前对深海热液生态系统的认识还比较肤浅。不同地质背景的热液成分及生物群落组成具有独特性，目前对各大洋的热液生态系统的分布与生物种群特征还没有全面的了解。对古菌、细菌以及噬菌体等在深海生态系统的形成与维持过程中的作用，还有很多问题等待解答，热液活动在地球生命起源中的作用仍是一个谜。
记者：深海微生物是深海生态系统的重要成员，请您介绍一下国际上深海微生物调查研究的情况。
邵宗泽：微生物是深海生态系统中的重要组成部分，与其他海洋生物形成了密切的共附生关系。深海极端高温、低温、有氧、无氧等各种各样的环境条件选择出了多种多样的微生物。营养贫乏的大洋环境造就了寡营养的海洋微生物，寡营养微生物以其精简的基因组和特殊的代谢机制适应了特殊的深海环境。总的来说，各种古菌、细菌、噬菌体广泛分布于整个海洋环境，构成了独特的“深部生物圈”，它们在地球生物化学循环中起着重要作用。
其中，深海化能自养微生物对热液及海底冷泉生态系统的形成至关重要。用时8年的化能自养生态系统计划（ChEss project）对南大西洋、南太平洋等四个海区的深海化能自养生态系统进行了调查。在位于南太平洋开曼海槽（Cayman trough）的超慢速扩张洋中脊，发现了水深最深热液口（6800米），生态环境独一无二；在南大西洋中脊发现了最热的热液口，还在新西兰附近发现了巨大的深海冷泉区，在北极的摩恩（Mohns Ridge）发现了大量的硫氧化菌席。
深海沉积物也是一个巨大的、天然的DNA资源库，仅位于深海沉积物顶部的10厘米空间，据估算约含有4.5亿吨脱氧核糖核酸（DNA）。已经证实，海底1626米以下的沉积物中也有微生物活动。深海中蕴藏着地球上最为丰富的物种多样性和最大的生物量，被公认是未来重要的基因资源来源地，具有巨大的应用开发潜力。
随着环境基因组、宏蛋白组等组学分析技术的进步，对海洋微生物的认识取得了重大进展。美国克雷格?文特尔研究小组开展的海洋微生物环境基因组系列调查发现，仅在表层海水就有大量的微生物新物种、新基因、新蛋白、新途径。这些微生物新物种、新蛋白家族、新代谢过程的科学价值、环境作用和资源价值目前难以估量。
记者：目前，深海生物基因资源已成为各国在国际海底竞相角逐的战略资源，能不能介绍一下国际社会的看法与态度？
邵宗泽：人类对海洋生物基因资源知识产权的拥有量每年在以12%的速度快速增长，目前有超过18000个天然产物和4900个专利与海洋生物基因有关，说明它不再只是个应用远景，而是一类现实的可商业利用的重要生物资源。基因组测序技术与生物信息技术的发展，大大加速了海洋微生物基因资源的发现与发掘速度。
目前，公海海洋生物基因资源的保护与可持续利用，以及知识产权归属已经成为联合国国际海底会议的重要议题。从2004年起，联合国会员大会成立了“国家管辖以外海域的海洋生物多样性工作组”，每两年召开正式会议磋商，我国每次由外交、管理人员和学术专家应邀组团参加，目前还没有被国际社会广泛接受的法律框架来保护和规范海洋生物基因资源的开发。
发达国家与发展中国家因各自的经济实力、深海调查能力的差异，对海底遗传资源生物勘探所持的态度也不一致。发达国家坚持先入为主、自由采探，主张知识产权的保护。相反，发展中国家主张“人类共同遗产”原则，坚持利益共享，不支持公海海洋生物基因资源知识产权的申请保护。
记者：我国近年来在我国大洋深海生物基因资源勘探方面的研究进展与现状如何？
邵宗泽：我国在“十五”期间就启动了深海生物及其基因资源的相关研究，并依托国家海洋局第三海洋研究所建立了中国大洋生物基因研发基地。在深海微生物研究装备的研制、深海微生物基础科学研究以及资源开发应用方面取得了重要进展。从2003年起，初步建立了我国第一个深海微生物资源库。2005年起，在国家自然科技资源共享平台的支持下，在深海微生物资源库的基础上建立了中国海洋微生物菌种保藏管理中心。经过六年积累，分离了大量新的大洋微生物资源，并通过资源的标准化、规范化整理，建立了资源共享平台。
“十一五”期间，在大洋协会洋中脊项目支持下，发表深海微生物研究论文200多篇，其中147篇SCI文章发表在美国科学院院刊等重要学术刊物上。在极端微生物资源获取、极端酶研究、活性物质筛选以及微生物多样性分析等方面取得了重要进展，初步形成了集大洋生物基因资源勘探及大洋科学研究于一体的优秀团队。
“十二五”期间，在深海生物调查技术能力、深海（微）生物勘探与资源潜力评估以及微生物资源开发方面，已经得到了在科技部、海洋局、大洋协会等各 类项目大力支持，有望获得更大的进展。
2.1990-2010年中国土地利用变化对生物多样性保护重点区域的扰动
3.青藏高原高寒草甸植物群落生物量对氮、磷添加的响应
4.新疆连作棉田施用生物炭对土壤养分及微生物群落多样性的影响
5.荒漠草地4种灌木生物量分配特征
6.旱地土壤施用生物炭减少土壤氮损失及提高氮素利用率
7.生物肥部分替代化肥对花椰菜产量、品质、光合特性及肥料利用率的影响
8.不同秸秆生物炭对红壤性水稻土养分及微生物群落结构的影响
9.生物炭对土壤生境及植物生长影响的研究进展
10.沙质草地不同生活史植物的生物量分配对氮素和水分添加的响应
11.大兴安岭5种典型林型森林生物碳储量
12.水稻秸秆生物炭对耕地土壤有机碳及其CO_2释放的影响
13.土壤重金属钝化修复剂生物炭对镉的吸附特性研究
14.生物炭对不同土壤化学性质、小麦和糜子产量的影响
15.生物炭施用对矿区污染农田土壤上油菜生长和重金属富集的影响
16.准噶尔荒漠6种类短命植物生物量分配与异速生长关系
17.生物炭对土壤中微生物群落结构及其生物地球化学功能的影响
18.生物炭对水中五氯酚的吸附性能研究
19.生物炭和有机肥处理对平邑甜茶根系和土壤微生物群落功能多样性的影响
20.生物炭对旱作农田土壤理化性质及作物产量的影响
21.中国南方3种主要人工林生物量和生产力的动态变化
22.南海北部边缘盆地生物气/亚生物气资源与天然气水合物成矿成藏
23.基于多源遥感数据的草地生物量估算方法
24.生物炭对农田土壤微生物生态的影响研究进展
25.生物炭对土壤理化性质影响的研究进展
26.生物扰动对沉积物中污染物环境行为的影响研究进展
27.生物炭与秸秆添加对砂姜黑土团聚体组成和有机碳分布的影响
28.近十年中国生物入侵研究进展
29.荒漠灌木生物量多尺度估测——以梭梭为例
30.土壤有机污染物生物修复技术研究进展
31.生物医学大数据的现状与展望
32.黑河中游荒漠草地地上和地下生物量的分配格局
33.生物大灭绝研究三十年
34.不同热解温度生物炭对Cd(Ⅱ)的吸附特性
35.农用生物炭研究进展与前景
36.生物炭对水稻根系形态与生理特性及产量的影响
37.施用生物炭对旱作农田土壤有机碳、氮及其组分的影响
38.不同生物质来源和热解温度条件下制备的生物炭对菲的吸附行为
39.城市生物多样性分布格局研究进展
40.生物炭的土壤环境效应及其机制研究
41.辽河源不同龄组油松天然次生林生物量及空间分配特征
42.稻壳基生物炭对生菜Cd吸收及土壤养分的影响
43.小兴安岭7种典型林型林分生物量碳密度与固碳能力
44.东北林区4个天然针叶树种单木生物量模型误差结构及可加性模型
45.指数施肥对楸树无性系生物量分配和根系形态的影响
46.牛粪生物炭对水中氨氮的吸附特性
47.黄土丘陵区生物结皮对土壤物理属性的影响
48.半干旱沙地生境变化对植物地上生物量及其碳、氮储量的影响
49.青藏高原东缘野生暗紫贝母生物量分配格局对高山生态环境的适应
50.长江口及东海春季底栖硅藻、原生动物和小型底栖生物的生态特点
51.全球生物多样性评估方法及研究进展
52.中国生物多样性就地保护的研究与实践
53.温度与降水协同作用对短花针茅生物量及其分配的影响
54.环境质量评价中的生物指示与生物监测
55.土壤生物多样性研究:历史、现状与挑战
56.转录因子对木质素生物合成调控的研究进展
57.太赫兹科学技术在生物医学中的应用研究
58.玉米秸秆生物炭对Cd2+的吸附特性及影响因素
59.中国粮食作物秸秆焚烧排碳量及转化生物炭固碳量的估算
60.生物炭对我国南方红壤和黄棕壤理化性质的影响
61.黑龙江省大兴安岭森林生物量空间格局及其影响因素
62.不同生物质原料水热生物炭特性的研究
63.凤眼莲、稻草和污泥制备生物炭的特性表征与环境影响解析
64.东北地区两个主要树种地上生物量通用方程构建
65.不同来源生物炭对砷在土壤中吸附与解吸的影响
66.生物炭生产与农用的意义及国内外动态
67.秸秆生物反应堆与菌肥对温室番茄土壤微环境的影响
68.生物炭对土壤肥料的作用及未来研究
69.玉米秸秆生物炭对土壤无机氮素淋失风险的影响研究
70.黄土丘陵区生物结皮对土壤可蚀性的影响
71.内蒙古草甸草原与典型草原地下生物量与生产力季节动态及其碳库潜力
72.生物炭添加对黄土高原典型土壤田间持水量的影响
73.生物炭对黄土区土壤水分入渗、蒸发及硝态氮淋溶的影响
74.生物炭及其复合材料的制备与应用研究进展
75.生物炭及炭基硝酸铵肥料对土壤化学性质及作物产量的影响
76.臭冷杉生物量分配格局及异速生长模型
77.施用生物炭后塿土土壤微生物及酶活性变化特征
78.宁夏荒漠草原不同群落生物多样性与生物量关系及影响因子分析
79.中国生物多样性调查与保护研究进展
80.三种小球藻生物柴油品质指标评价
81.AM真菌对重金属污染土壤生物修复的应用与机理
82.含度量误差的黑龙江省主要树种生物量相容性模型
83.生物炭与农业环境研究回顾与展望
84.氮磷添加对巨桉幼苗生物量分配和C:N:P化学计量特征的影响
85.生物炭对土壤肥力与环境质量的影响机制与风险解析
86.东北林区天然白桦相容性生物量模型
87.氮肥与生物炭施用对稻麦轮作系统甲烷和氧化亚氮排放的影响
88.黄土高原丘陵区生物结皮土壤的斥水性
89.检测食品沙门氏菌的生物传感器持久性研究
90.生物炭对砂壤土节水保肥及番茄产量的影响研究
91.土壤碳收支对秸秆与秸秆生物炭还田的响应及其机制
92.抑制烟草青枯病型生物有机肥的田间防效研究
93.生物炭对塿土土壤含水量、有机碳及速效养分含量的影响
94.生物炭对宁夏引黄灌区水稻产量及氮素利用率的影响
95.茶叶生物化学研究进展
96.鄂尔多斯盆地西缘奥陶纪生物礁基本特征、分布规律及成礁模式
97.中国履行《生物多样性公约》二十年:行动、进展与展望
98.不同时期施用生物炭对稻田N_2O和CH_4排放的影响
99.生物炭对设施连作黄瓜根域基质酶活性和微生物的调节
100.生物有机肥对连作蕉园香蕉生产和土壤可培养微生物区系的影响
101.柴达木盆地几种荒漠灌丛植被的生物量分配格局
102.牛粪生物炭对磷的吸附特性及其影响因素研究
103.红树林植物生物量研究进展
104.农业活动及转基因作物对农田生物多样性的影响
105.煤矸石场植被自然恢复初期草本植物生物量研究
106.铁改性生物炭对磷的吸附及磷形态的变化特征
107.青藏高原草地地下生物量与环境因子的关系
108.蔬菜种植农户施用生物农药意愿研究
109 生物炭对夏玉米生长和产量的影响
110.不同生物炭添加量下植烟土壤养分的淋失
111.生物DNA条形码:十年发展历程、研究尺度和功能
112.生物炭和生物炭基氮肥的理化特征及其作物肥效评价
113.木质素与生物燃料生产:降低含量或解除束缚?
114.生物炭添加对半干旱地区土壤温室气体排放的影响
115.磷回收对厌氧/好氧交替式生物滤池蓄磷/除磷的影响
116.天山林区六种灌木生物量的建模及其器官分配的适应性
117.非模式生物转录组研究
118.添加生物炭对灌淤土土壤养分含量和氮素淋失的影响
119.生物炭和腐植酸类对猪粪堆肥重金属的钝化效果
120.间伐对川西亚高山粗枝云杉人工林细根生物量及碳储量的影响
121.生物多样性信息学研究进展
122.长白落叶松林龄序列上的生物量及碳储量分配规律
123.不同烧制温度下玉米秸秆生物炭的性质及对萘的吸附性能
124.利用农业生物多样性持续控制有害生物
125.腾格里沙漠东南缘4种灌木的生物量预测模型
126.生物炭碳封存技术研究进展
127.猪粪制备的生物炭对西维因的吸附与催化水解作用
128.生物炭修复土壤重金属污染的研究进展
129.古尔班通古特沙漠4种荒漠草本植物不同生长期的生物量分配与叶片化学计量特征
130.生物炭覆盖对底泥污染物释放的影响
1.DGGE技术的原理
变性梯度凝胶电泳（DGGE）是根据小片段DNA分子（1kb以下）的熔解温度不同来分析DNA分子的多样性，理论上可以检测到单个碱基替换的DNA分子。DN段在丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于自身的物理性状，熔解状态的DNA分子片段在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速度比双链DNA分子慢[4]。当DN段处在变性剂浓度不断增加的凝胶系统中，随着电泳的迁移就会部分融化，达到一定变性剂浓度时DNA就会熔解为单链的分子，这些离散的碎片集中在一个比较狭窄的变形梯度范围内，这样不同的DNA分子在不同变性剂浓度下熔解，在整个电泳图谱中成楼梯式排列。通过对比熔解状态下DN段的多态性，就可以推测有碱基突变或序列差异的DNA分子片段。
为了提高检出率可在DNA一端加入一个高熔点区―GC夹（GC clamp）；GC夹就是在一侧引物的5′端加上一个30～40bp的连续GC碱基，这样在PCR产物的一侧可产生一个GC夹的高熔点区，从而使相应的部分序列处于低熔点区而便于检测分析；这样，DGGE的突变检出率可提高到接近于100%[4]。
2.DGGE技术在微生物生态学中的应用
自然界中85%～99.9%的微生物是不可纯培养的[5]，并且微生物的形态具有难观测性和可变性，在传统的实验方法下不能提供足够的微生物学信息，这严重阻碍了对自然环境中微生物构成及特征的客观认识。PCR-DGGE 技术在微生物生态学中的一个最主要的应用就是分析微生物群落构成，Muyzer 等人于1993年首次将DGGE技术应用于微生物膜系统和生物菌苔的群落多样性分析。此后，该技术被广泛应用于各种微生物生态系统的检测，绝大部分研究都是通过扩增原核生物 16S rDNA 基因来研究各生态系统中的古细菌或细菌的群落多样性[6]，或者用真菌的通用引物扩增18SrDNA 基因，从而研究真菌的群落多样性，另外除了通过rDNA基因来分析微生物群落结构组成外，还可以通过扩增功能性基因来研究功能基因及功能菌群的差异。
Lam等利用DGGE技术对真菌18SrDNA的序列进行分析，研究Magnolia liliifera叶片中真菌的多样性，结果在叶片的不同部位得到通过培养和形态学研究未能得到的14株不同菌株[7]。Eeva等对挪威红杉残枝样本直接进行DNA提取，利用DGGE分析通过FR1和NS1引物对扩增的1650 bp rDN段，结果得到了46株木材腐烂真菌，为真菌群体中难培养的菌株的检测提供了新的方法[8]。Zhou等对藏灵菇发酵液里的真菌和细菌的DNA进行提取后，扩增细菌16SrRNA和真菌28SrRNA上的相应片段，之后用DGGE进行分析得到11株优势菌株，并且在不同样本之间细菌存在78～84%的相似度，酵母存在80-92%的相似度[9]。
PCR-DGGE 技术在微生物生态学中的另一个重要应用是检测微生物的动态变化。宋亚娜等运用16SrDNA和18S rDNA特异性引物对，将土壤中提取的总DNA进行PCR扩增后，通过DGGE技术对PCR产物进行分析，研究不同间作和轮作种植体系对作物根际真菌和细菌菌落结构的影响，结果表明，间作明显改变玉米的根际细菌、真菌的菌落结构[10]。Takada利用PCR-DGGE研究化学熏蒸后对散土和菠菜根部土壤中真菌群落的变化，结果表明，三氯硝基甲熏蒸两个月后，在散土和菠菜根部土壤中真菌的多样性都减少，并且一年后真菌的多样性并没有完全恢复到原来的水平，但是菠菜根部土壤中真菌减少量比散土中要少，1，3-二氯丙烯处理两个月后，真菌的多样性只发生微小的改变，并且六个月后就与对照组没有显著差异了[11]。
PCR-DGGE技术还可用于发现新的微生物菌株。Santegoeds等通过DGGE分析细菌16SrRNA上的基因片段来检测多次富集培养的菌藻系，得到了14条独特的16SrRNA基因序列，其中有10个细菌株的基因是以前利用纯培养手段及单纯的分子技术方法均没有发现的[12]。
3.DGGE技术的局限性及改进方法
DGGE 技术作为一种分子生物学手段在研究微生物群落的动态行为和复杂性方面发挥着重要的作用，是目前被普遍接受的的分子生物学工具，但是作为一种分子水平上的技术，除了具有多数分子技术所固有的缺点之外（如PCR产物偏差等），本身也有一定的应用局限性。
首先，利用DGGE分离的PCR产物一般要求DNA长度在200～ 700bp范围内[1]，超出该范围DGGE的分辨率会下降，然而这些序列只能提供有限的系统发育信息，不利于判断微生物所属的系统类群。其次，DGGE通常显示的是微生物群落中的优势种群，Muyzer研究发现该技术只能对菌体数量大于总菌量1%的菌群进行分析[1]。再次，每种菌可能含有数目不等的rRNA基因[13]，则可能会导致群落中菌株数量被过多的估计从而夸大群落差异性和多态性。另外，如果选用的条件不是特别适宜就不能保证将每类DN段完全分开，这样序列不同的DN段迁移到凝胶的同一位置，导致同一条带中含有不同种类的细菌[14]。
对于DGGE存在的这些缺限我们可以通过各种手段加以改善，例如可以优化电泳及PCR的条件从而减少误差，并且在进行DGGE之前通过软件来分析检测PCR过程中形成的嵌合体，另外，可以与其他技术方法相结合，如纯培养、直接形态观察、原位杂交、核酸探针检测技术等，这样不仅更客观的从多方面反映环境中微生物的多样性信息，还可以与其他方法相互补充，从而不断提高分子微生物生态学的研究水平。DGGE技术与传统方法或其它分子生物技术的结合进一步促进了人们对微生物生态的认识；随着分子生物学技术的快速发展，DGGE技术将会得到不断的补充和完善，必将在微生物生态研究中发挥更大的作用。
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中图分类号：Q93-335 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）10-2295-04
嗜碱菌是一类最适生长于pH大于或等于9的环境中的微生物，根据它们在pH 7 条件下生长与否可分为专性嗜碱菌和兼性嗜碱菌两大类[1，2]。对于嗜碱菌新菌株的分离、碱性蛋白酶的基因克隆和应用、极端环境适应机制、结构新颖的活性产物的分离都是当今极端环境微生物研究的热点[3-6]。嗜碱菌已广泛应用于发酵工业、石油化工、农作物生长改良和环境污染物的生物修复等多个领域[7，8]。目前，对嗜碱菌的嗜碱机理研究又有了新的重要突破[9]。
内蒙古有广阔的盐碱湖分布，蕴藏着丰富的微生物资源，其中嗜碱微生物呈现较高的生物多样性[10，11]。嗜碱菌有很高的经济价值和生产应用潜力，对其进行深入研究和开发利用，将成为我国战略生物资源的平台之一，有利于发挥生物技术创新的支撑作用。因此，对分离于浑善达克盐碱湖的一株嗜碱菌的基本特征进行了分析，以期为进一步认识和开发内蒙古地区的极端环境微生物资源奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 盐碱湖杆菌菌株 盐碱湖杆菌菌株MIM18由内蒙古农业大学生命科学学院应用与环境微生物研究所从内蒙古浑善达克盐碱湖中分离获得。
1.1.2 培养基
1）液体培养基。酵母粉2 g/L，蛋白胨2 g/L，K2HPO4 0.2 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，NaCl 10 g/L，微量元素1 mL/L，微生素 100 μL/L，pH 9～10。
2）固体培养基。在液体培养基中加入琼脂15 g/L制成。
3）半固体培养基。在液体培养基中加入琼脂4 g/L制成。
4）微量元素溶液配方（g/L）。FeCl3 0.05，MnSO4·H2O 0.02，H3BO3 0.01， CuSO4·5H2O 0.01，（NH4）6Mo7O24 ·4H2O 0.02，ZnSO4 0.01 g，EDTA 0.5，CaCl2·2H2O 0.2。
5）微生素溶液配方（g/L）。生物素 0.02，VB1 0.02，VB12 0.001，硫辛酸 0.05。
1.2 方法
1.2.1 形态特征和生长曲线的绘制 通过革兰氏染色和平皿划线培养的方法来观察MIM18的基本形态特征。将MIM18菌种接种于含100 mL液体培养基的250 mL三角瓶中，置33 ℃、200 r/min水浴摇床光照培养。隔时取样于600 nm处测定吸光度。以培养时间为横坐标，吸光度为纵坐标绘制生长曲线。
1.2.2 耐盐试验 调整培养基中盐浓度分别为0、10、20、30、40、50、55、60 g/L。固体培养基平皿划线光照培养测定MIM18的耐盐程度；液体培养基（装液量为100 mL/（250 mL），接种量2%）33 ℃、200 r/min水浴摇床培养3 d后于600 nm处测定吸光度，每个梯度3个平行[12，13]。
1.2.3 pH对生长的影响 调整培养基的pH分别为5.0、5.5、6.0、7.0、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、11.0、11.5、12.0，培养测定方法同1.2.2。
1.2.4 温度对生长的影响 采用含NaCl的培养基，分别置于0、24、27、30、33、36、40、42 ℃的条件下培养，培养测定方法同1.2.2。
1.2.5 氧气对生长的影响 半固体培养基穿刺培养，每12 h观察一次。观察菌体的生长情况及位置。液体静置和摇床培养，观察菌体在液体中的分布。
1.2.6 光照对产色素的影响 划线接种固体培养皿3个，两个平皿用锡箔纸包住避光培养，24 h后将锡箔纸中的一个平皿光照培养，另一个仍避光培养，第三个平皿一直光照培养。
1.2.7 产酶种类和抗生素敏感性分析 产酶种类测定参考《常见细菌系统鉴定手册》[14]和文献[15]中的方法进行。抗生素敏感性试验采用药敏纸片检测法[16]进行。
2 结果与分析
2.1 MIM18的生长曲线
通过7 d的恒温摇床培养和吸光度测定，绘制出MIM18的生长曲线（图1）。从图1可以清晰看到0～12 h为延滞期，12～72 h为指数生长期，72～120 h为稳定期，120 h后进入衰亡期。
2.2 盐浓度对MIM18生长的影响
经过培养，MIM18可在盐浓度0～55 g/L范围内生长。对比各盐浓度的生长状况发现，在盐浓度0～40 g/L时均能较好地生长。盐浓度为0 g/L时，菌落的颜色明显淡于盐浓度10～40 g/L时的菌落颜色（图2、图3）。盐浓度为50 g/L时，有少数菌落生长，盐浓度为55 g/L时只有5个左右的小菌落，盐浓度≥60 g/L时几乎不生长。说明低盐有利于MIM18的生长，过高的盐浓度将会抑制其生长。通过不同盐浓度培养后测定吸光度比较发现（图4），MIM18在盐浓度0～10 g/L范围内随着盐浓度升高有利于MIM18的生长，在盐浓度为10 g/L时生长情况最好；在盐浓度10～40 g/L时抑制MIM18的生长，但抑制效果不明显，当盐浓度为40 g/L以上时MIM18的生长明显受到抑制。
2.3 pH对MIM18生长的影响
经平板培养可知，MIM18适应pH变化能力较强，能在pH 6.0～11.0环境下生长。当pH≤5.5或≥11.5时该菌株不生长。当pH 6.0、7.0和11.0时该菌株生长比较缓慢；pH 8.5～10.0时MIM18生长随pH的增大逐渐加快，pH 9.5时最适生长，生长最快，也最先达到稳定期，之后生长量随pH增大而减小（图5）。
2.4 温度对MIM18生长的影响
经平板培养可知，MIM18的生长温度范围为24～40 ℃，大于40 ℃时不再生长。从图6可以看出，33～36 ℃为MIM18生长的适宜温度范围。
2.5 氧气对MIM18生长的影响
半固体培养基穿刺光照培养24 h后，穿刺孔上部有生长迹象，之后半固体斜面生长迹象加强，穿刺孔中生长迹象逐渐减弱直至消失；液体培养时，只在液面处生长，说明氧气是MIM18生长的必要条件，MIM18不具有运动性。摇床振荡培养与静置培养对比结果表明摇床培养条件下MIM18的生长状况明显优于静置培养，说明摇床培养提供的氧气对MIM18生长有重要作用。
2.6 光照对MIM18产色素的影响
如图7所示，3种光照处理方式下MIM18生长状况、菌落形态基本一致，说明光照对MIM18的色素合成乃至生长无影响。
2.7 MIM18的产酶种类和抗生素敏感性
经测定，该菌株在生长中产生接触酶（过氧化氢酶）、精氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧酶，不产生脲酶、苯丙氨酸脱氨酶、酯酶；甲基红和硫化氢试验为阳性；它对常见的抗生素（青霉素-G、红霉素、氯霉素、四环素、庆大霉素、氨苄青霉素、羧苄青霉素、罗红霉素、多粘菌素、卡那霉素、妥布霉素、利福平、杆菌肽）均表现为高度敏感。
3 结论与讨论
MIM18在盐浓度0～40 g/L范围内都能较好生长，适应能力较强，甚至在无盐条件下也能生长，在盐浓度10 g/L时就能达到最适盐浓度，说明其生长对盐量要求不大，当盐浓度超过40 g/L时生长明显受到了抑制，因此MIM18不是嗜盐菌[10]；MIM18不仅能在强碱条件下生长而且能在pH 7下生长，因此是兼性嗜碱菌[11]。另外，MIM18在温度方面要求也不十分严格，30～36 ℃生长差异不是很大。MIM18对pH和周围环境的氧气量变化很敏感，氧气是其生长的必要条件，光照对其色素合成乃至生长没有影响。
嗜碱菌是盐碱湖中数量大、分布广的极端微生物。由于其独特的环境适应模式，特殊的生理机制，独特的基因类型，并有多种代谢产物可以利用，因而不仅成为了生命科学理论研究的理想材料，而且成为一类具有很大开发潜力的生物资源[17]。近年来，嗜碱微生物的研究发展迅速，已应用于诸如清洁剂生产[18]、生物表面活性剂[19]、农作物生长促进剂[20]和天然产物的生物转化、环境污染物降解[8，21，22]等多个方面。对盐碱湖菌的深入研究，不仅可以开发新的微生物基因资源，而且将大大促进微生物在人类健康、环境保护和生物技术等领域的利用。
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中图分类号 S451 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）20-0084-03
Effects of Lantana camara Invasion on Soil Physical-chemical Properties in Rhizosphere and Non-rhizosphere Zone
KANG Xiao-wu DAI Ting-ting
（Institute of Tropical and Subtropical Ecology，South China Agricultural University，Guangzhou Guangdong 510642）
Abstract The effects of L.camara invasion on rhizosphere and non-rhizosphere soil nutrients，soil enzyme activities，microbial biomass with microbial functional diversity were studied by quadrat experiment in the field.The experimental results showed that the invasion of L.camara significantly improved the content of soil organic matter，total nitrogen，total potassium，nitrogen，available phosphorus，potassium and microbial biomass carbon，nitrogen，phosphorus.At the same time，the invasion significantly improved the activity of soil urease，protease，sucrosemetabolic，cellulase，catalase and the metabolic activity，carbon source utilization and diversity index of soil microbial community.The promoting effect was higher on the rhizospheric soil than on the non-rhizospheric soil （bulk soil）.
Key words bioinvasion；Lantana camara；rhizosphere soil ；soil physical-chemical properties
马缨丹（Lantana camara）为马鞭草科（Verbenaceae）马缨丹属（Lantana）多年生常绿灌木，原产于热带美洲，现广泛分布于热带、亚热带和温带地区，是世界上危害最严重的100种有害外来入侵物种之一[1]。马缨丹作为一种外来入侵植物，植株繁殖能力强，蔓延迅速，能够在短时间内大面积侵占森林、果园、牧场和农耕地，破坏当地的生物多样性和自然生态系统，并因其植株有毒而严重威胁到人畜健康和农牧业生产[2-3]。1645 年马缨丹作为一种观赏花卉引入我国，现已在广东、广西、海南、云南等地大量蔓延扩散，对当地的生物多样性、农业生产和生态安全造成严重威胁[4-5]。
有研究表明，一年蓬（Erigeron annual Fleabane）、加拿大蓬（Erigeron canadensis）、加拿大一枝黄花（Solidago canad-ensis）等植物入侵后对根际土壤理化性质产生了不同程度的影响[5-6]；外来入侵植物紫茎泽兰（Eupatorium adenopho-rum）、黄顶菊（Flaveria bidentis）等可以不同程度地提高入侵地土壤的全磷养分和速效养分[7-8]。目前，国内外学者在马缨丹的生物学特性、分布危害、防治以及开发利用等方面开展了大量的工作，但对马缨丹植株的化感作用及其入侵对土壤微生态特性的影响研究较少[9-15]。笔者通过野外样方试验，研究了马缨丹入侵对根际、非根际的土壤养分、土壤酶活性、土壤微生物生物量与土壤微生物功能多样性的影响效应，旨在从化感作用、土壤反馈作用的角度探索马缨丹的入侵机制及入侵效应，从而为更好地管理、控制马缨丹的入侵危害提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
马缨丹单优群落的根际土壤与非根际土壤均采自于华南农业大学增城教学基地。
1.2 试验方法
在华南农业大学增城教学科研基地，选取马缨丹单优群落（马缨丹植株覆盖率80%～90%，群落高度150～250 cm，入侵年限大于6年）内的健壮植株，用锄头挖取植株地下根系（0～20 cm），抖去根系上的大块土壤，然后用细毛刷刷取根系表层黏贴的土壤，去除杂质后作为根际土壤，而拌落后的大块土壤作为非根际土壤；同时选取距离马缨丹群落50 m以外，且周围都没有马缨丹植株生长的荒坡草地的表层土壤（0～10 cm）作为对照（CK）。每个处理3次重复，每次重复之间相隔200 m以上。将采集的土壤装袋运回实验室，其中一部分土样置于室内自然风干，除去动植物残体，研磨过100目筛，用于土壤养分含量、土壤酶活性的测定分析；另一部分样品暂时冷藏于-18 ℃冰箱，用于测定土壤微生物生物量碳、氮、磷。
1.3 数据统计方法
所有试验数据均在Microsoft Excel上完成处理，通过SPSS 13.0进行方差分析（one way ANOVA），并采用Duncan新复极差法进行多重比较。
2 结果与分析
2.1 马缨丹入侵对根际、非根际土壤全量、速效养分的影响
2.1.1 土壤全量养分。土壤有机质、全氮（TN）和全钾（TK）含量在各处理中的变化规律一致，即根际土壤的含量最高，非根际土壤次之，CK的含量最小，各处理的差异显著（表1）。其中与 CK相比，根际土壤的有机质、TN和TK含量分别增加40.77%、38.13%、30.16%；而与非根际土壤相比，则分别增加23.24%、14.97%和13.11%。对于土壤TP含量，根际土壤分别比CK、非根际土壤增加65.22%、58.33%，差异显著；而非根际土壤的TP含量虽略高于CK，但差异不显著。说明马缨丹入侵能显著提高自身根际的土壤有机质、TN、TP和TK含量，同时也显著提高非根际的土壤有机质、TN和TK的含量，但相对而言，其对根际土壤养分的提升效果更加明显。
2.1.2 土壤速效养分。在3个处理中，马缨丹根际土壤的碱解氮含量最高，并且显著高于非根际土壤和CK，而非根际土壤的碱解氮含量虽然略高于CK，但两者的差异不显著（表2）。对于土壤的速效磷、速效钾含量，均表现为根际土壤的含量最高，非根际土壤的含量次之，CK的含量最低，各处理间的差异显著。其中与CK相比，根际、非根际土壤的碱解氮含量分别增加32.67%和0.75%，速效磷含量分别增加87.14%和48.87%，速效钾含量分别增加115.70%和62.72%，可见马缨丹入侵能显著提高土壤碱解氮、速效磷和速效钾含量，尤其是对根际土壤的养分提升作用更强。
2.2 马缨丹入侵对根际、非根际土壤酶活性的影响
与CK相比，马缨丹入侵显著提高了土壤脲酶、蛋白酶活性，其中根际土壤的脲酶、蛋白酶活性分别比CK提高104.06%和74.34%，非根际土壤的脲酶、蛋白酶活性也分别比CK增加45.53%和46.90%。可见，马缨丹入侵对根际土壤脲酶、蛋白酶活性的促进效果更强。土壤蔗糖酶、纤维素酶的活性变化也呈现类似的规律，即在3个处理中均表现为根际、非根际土壤的酶活性显著高于CK，且根际土壤的酶活性亦显著高于非根际土壤（表3）。其中根际、非根际土壤的蔗糖酶活性分别是CK的227.56%和157.11%，纤维素酶活性分别是CK的264.39%和161.73%。可见，马缨丹入侵能显著提高根际、非根际土壤中蔗糖酶和纤维素酶的活性，加强对土壤中有机碳的利用，并且这种增强效应在根际土壤的表现更为显著。另外，马缨丹入侵亦能显著提高自身根际、非根际土壤的过氧化氢酶活性，与CK相比，其增幅分别达到45.95%和27.03%
2.3 马缨丹入侵对根际、非根际土壤微生物生物量的影响
土壤微生物生物量碳、氮、磷含量在各个处理中的变化规律一致，均表现为根际、非根际土壤含量显著高于CK，同时根际土壤含量亦显著高于非根际土壤（表4）。其中与CK相比，根际土壤微生物生物量碳、氮、磷的含量分别提高238.76%、53.55%、243.61%，非根际土壤微生物生物量碳、氮、磷含量也分别提高130.31%、14.34%、124.15%。可见，马缨丹入侵对根际土壤微生物生物量碳、氮、磷含量的提升效应更强。
2.4 马缨丹入侵对根际、非根际土壤微生物群落功能多样性的影响
2.4.1 土壤微生物群落代谢活性。平均孔颜色变化率（average well color development，AWCD）反映土壤微生物利用碳源的整体能力与代谢活性，也是评价利用单一碳源能力的重要指标，可作为微生物整体活性的有效指标。AWCD 值的变化（斜率）和最终能达到的值反映了土壤微生物利用某一碳源物质的能力。由图1可知，各处理中土壤微生物的AWCD值均随着培育时间的延长不断上升，变化趋势一致。在最初的24 h内AWCD变化较小，24～72 h急剧上升，然后持续缓慢升高。培养期间CK土壤微生物群落的AWCD值均处于较低水平，根际土壤微生物群落的AWCD值则处于最高水平，各处理的AWCD在整个培育周期内均表现为根际土壤>非根际土壤>CK，其中根际土壤在培养24 h后一直到培养结束，其微生物群落的AWCD值均显著高于CK，亦显著高于非根际土壤；而非根际土壤在0～72 h内的AWCD值与CK差异不显著，72 h后与CK差异显著。这说明马缨
丹入侵后明显提高了土壤微生物群落的代谢活性，并且对根际土壤的影响效应更明显。
2.4.2 土壤微生物群落碳源利用率。在6类碳源中，马缨丹非根际土壤微生物群落对氨基类、酚类碳源的利用率与CK的差异不显著，但对其他碳源的利用率则显著高于CK（表5）。而根际土壤微生物群落对6类碳源的利用率均显著高于CK，亦显著高于非根际土壤，其中根际土壤微生物群落对碳水化合物类、羧酸类、聚合物类、氨基酸类、酚类和胺类碳源的利用率分别比CK增加96.91%、83.70%、82.43%、41.13%、55.74%和110.45%。可见，马缨丹入侵显著提高了土壤微生物群落对6种碳源的利用率，尤其对根际土壤的改善作用更强。
2.4.3 土壤微生物群落碳源利用的多样性。与CK相比，马缨丹入侵显著提高了根际土壤微生物群落的Shannon-Wiener指数H′、Mc Intosh指数U、丰富度指数S和Simpson优势度指数Ds，而非根际土壤微生物群落的Mc Intosh指数U、丰富度指数S也显著上升。对于Pielou均匀度指数E，各处理的差异均不明显。说明马缨丹入侵能够促进土壤微生物群落功能多样性的提高，尤其对根际土壤的影响更强。
3 结论与讨论
植物对土壤养分的吸收利用与土壤对植物生长发育过程中的反馈作用是物种竞争取胜的重要驱动机制之一[16]。大多数研究指出，外来植物入侵能够加快土壤营养循环过程，提高土壤肥力，有利于促进自身的进一步入侵扩散。外来植物皱果苋入侵后，土壤中碳、氮、磷的浓度显著上升，其中入侵区的全磷、可溶性磷几乎分别提高3倍和2倍[17]。土壤酶主要来源于土壤微生物的代谢过程和土壤中植物、动物的活体分泌或残体分解，能够参与土壤生态系统许多重要的生物化学过程和物质循环，通过催化土壤中的生化反应发挥重要作用，能够客观地反映土壤肥力状况与系统功能[18-21]。土壤微生物生物量是土壤中最活跃的肥力因子之一，参与土壤有机质分解、腐殖质形成和土壤养分的循环转化过程，能够反映土壤同化与矿化能力的高低，是土壤生态系统肥力的重要生物学指标[22]。在外来植物与本地植物的关系中，土壤微生物群落可能起到了桥梁作用，外来植物通过改变土壤微生物群落的结构组成、区系数量与生理功能，破坏土著植物与土壤微生物在长期演化过程所形成的平衡共生关系，影响土著种的资源获取、生长繁殖与种群更新，从而使自身在竞争中获得更大优势，成功入侵[23-25]。
本研究结果表明，马缨丹入侵后，根际、非根际土壤的有机质、全氮、全磷和全钾均显著上升，并且马缨丹入侵对根际土壤养分的提升效果更为显著，根际土壤的有机质、全氮、全钾含量均显著高于非根际土壤。同时，马缨丹入侵亦能显著提高土壤的速效养分，马缨丹根际、非根际土壤中的碱解氮、速效磷和速效钾均显著高于对照；并且马缨丹根际土壤的速效养分亦显著高于非根际土壤。可见，马缨丹入侵显著提高了土壤不同肥力特征，且对根际土壤肥力的提高作用更强，而根际土壤的养分更有利于根系的吸收利用，这可能是马缨丹能够入侵成功和快速扩张蔓延的生态机制之一。马缨丹的入侵显著提高了土壤脲酶、蛋白酶、蔗糖酶、纤维素酶和过氧化氢酶的活性，且根际土壤酶的活性均显著高于非根际土壤。这说明马缨丹的入侵有利于土壤营养物质的循环转化过程。入侵区土壤酶活性较高，这将有利于活化土壤养分，提高其有效性，进而促进自身的入侵蔓延。马缨丹入侵能够显著提高土壤微生物生物量碳、氮、磷的含量，且根际土壤的微生物生物量碳、氮、磷含量显著高于非根际土壤。马缨丹入侵后能显著提高土壤微生物群落的代谢活性、碳源利用率和多样性指数，并且其对根际土壤的影响效应显著高于非根际土壤。说明马缨丹入侵后能通过提高自身生境土壤的微生物群落代谢活性从而促进土壤养分循环与转化，这也许是马缨丹成功入侵扩散的原因之一。本文仅研究探讨了马缨丹入侵对土壤养分、土壤微生物生物量、土壤微生物功能多样性的影响效应，而关于土壤微生物群落结构的变化及其反馈作用，可进一步阐明马缨丹成功入侵以及对本地植物生长影响的土壤生态学机理，今后可加强该方面的研究。
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