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doi：10.3969/j.issn.1004-7484（s）.2013.11.816 文章编号：1004-7484（2013）-11-6794-02
显微镜是基层检验科工作中常用设备之一，是临床诊断及生物学检查的重要检测器械，对疾病临床诊断具有重要指导意义。本文将对2012年2月――2013年2月期间我院进行治疗患者的新鲜晨尿80份作为研究对象，对比显微镜检验技术和全自动尿沉渣分析仪检测结果，其宗旨为加强显微镜检验技术在基层检验科的应用提供数据依据，现将结果报道如下。
1 资料与方法
1.1 临床资料 选择2012年2月――2013年2月期间我院进行治疗患者的80份新鲜晨尿（血尿）20ml作为研究对象，且均经肾脏病理检查确诊为肾小球血尿。
1.2 方法 对所采集的新鲜晨尿平均分为两个试管，一试管采用UF-100全自动尿沉渣分析仪，并严格参照操作说明书进行检验，另一试管采用光学显微镜检验技术检验，具体操作如下：将标本采用离心机，以1500r/min速率离心5min后，去除上清液，取底部0.2ml带沉淀的液体，将保留液充分摇匀后均匀涂片镜检，高倍镜下将RBC和WBC分为20个视野进行观察，以平均数为统计量，低倍镜下对管型分为10个视野进行观察，以平均数为统计量。双人双盲法计算平均值，尿液标本在收集后2h内检测完毕。
1.3 观察指标 观察对比两组检验方法对红细胞形态检验结果及与肾脏病理的符合情况。
1.4 评价标准
1.4.1 UF-100全自动尿沉渣分析仪检测 参考Hyodo提供的参考标准：①非肾小球性血尿，80%红细胞前前向散光射强度（FSC）≤84ch，呈均一性红细胞；②肾小球性血尿，FSC≤126ch且84ch，呈非均一性红细胞；③混合性血尿，FSC介于两者之间。
1.4.2 显微镜检测 镜下血尿为每高倍视野均可见≥3个红细胞。①肾小球血尿，畸形红细胞80%，呈非均一性红细胞；③混合性血尿，介于两者之间。
2 结 果
全自动尿沉渣分析仪和光学显微镜对80份血尿标本进行检验并与肾脏病理比较，其光学显微镜肾小球血尿检出率为83.75%，明显高于全自动尿沉渣分析仪的67.5%，两种检验方法比较差异具有统计学意义，P
3 讨 论
随着医疗技术进步，先进检验设备逐渐应用于检验科，其自动化水平高，可简化操作流程，降低检验污染率，快速有效为临床提供检出结果，但因受干扰物等因素的影响，可能会出现假性结果或漏检，而应用光学显微镜检查，因其观察检验标本具有直观、简便、特异性好等优点，可显著提高检出率，具有较高临床检验价值。
本文研究中，收集临床数据资料作为加强显微镜检验技术在基层检验科应用的依据，分别采用全自动尿沉渣分析仪和光学显微镜对80份血尿标本进行检验并与肾脏病理比较，其光学显微镜肾小球血尿检出率为83.75%，明显高于全自动尿沉渣分析仪的67.5%，结果提示，全自动尿沉渣分析仪对血尿标本检查起到筛查作用，而显微镜检查相对来说才是“金标准”。尽管显微镜检查操作繁琐且操作要求较高，但临床检出率较高，为此临床应加强显微镜检验技术在基层检验科的应用，进一步提高检出率。
由此，本文将加强显微镜检验技术的临床应用体会总结如下：①加强对显微镜技术的重视，基础检验科检验人员应正确认识显微镜技术在临床诊断中的积极临床意义，由于显微镜下形态学涉及血液、体液、微生物学及免疫学，为此工作人员应熟悉掌握检验医学各个亚专业及特点，如对高菌群失调引起的腹泻诊断中，显微镜下直接涂片后即可做出初步诊断，并将分泌物进行培养检验，即可发现致病菌株，对临床针对性用药具有重要临床价值；②摒弃对显微镜检验消耗时间、人力、精力的错误观点，使其认识到显微镜检测阳性细菌结果明显并其他先进仪器检测更为准确等优点，定期开展显微镜临床应用知识培训，正确引导使用显微镜的技巧，积累工作经验，以此加强检验工作人员的业务能力及检验技能，并提高显微镜检验准确率；③医院及检验科领导加强对检验科质量监督，要求检验人员严格遵守显微镜检测流程，对全自动尿沉渣分析仪等先进仪器检验后，再应用显微镜技术复查，确保检验结果准确性，为临床诊断及治疗提供理论支持。
综上所述，显微镜检验技术是基层检验科不可缺少的重要检验工作环节，积极加强显微镜检验技术的应用，促进科学、规范化显微镜检验，对提升医学形态学检验水平有重要的临床价值。
参考文献
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光波的限制
早在公元前1世纪，人们就已经发现了这么一个现象：通过球形透明物体去观察微小的物体时，可以使其放大成像。1590年，荷兰和意大利的眼镜制造者已经造出类似显微镜的放大仪器。1665年前后，英国生物学家胡克发明了类似现在学校实验室里用的显微镜，并通过这台显微镜看到了软木中网格状的结构，胡克称之为细胞。这是人类历史上最伟大的发现之一，大大推动了生物学的发展。
自从显微镜发明以来，科学家就不断对它进行改进，期待获得更大的放大倍数和更高的分辨精度。1873年，德国显微镜学家恩斯特・阿贝通过计算发现，由于光波相互干扰的原因，光学显微镜不能无限度地放大微小物质，最多只能“看到”光波波长一半的物质，即尺寸不小于200纳米的物质。这就是有名的“阿贝原则”，200纳米也被称为光学显微镜的“绕射极限”。
“阿贝原则”公布之后，科学家感到十分沮丧，因为分子和原子的尺寸大多在200纳米以下。也就是说，光学显微镜似乎难以“看到”分子和原子所活动的纳米世界了。打个比方来说，如果生命是一座城市，那么细胞就是城市中的每一个房间。我们肉眼只能看到生命“城市”和器官、组织等“建筑”，光学显微镜只能看到细胞“房间”，却难以看到“房间”内的物品。
因此，科学家开始发明多种能“看清”纳米世界的电子显微镜。这些显微镜居然可以看到最小尺寸为0.2纳米的原子，是光学显微镜精度的1 000倍！
让分子发光
正当电子显微镜大展身手的时候，分子生物学家很快发现了一个问题：在物理学和化学研究中得心应手的电子显微镜，到了分子生物学研究中往往有些“水土不服”。因为电子显微镜不能研究活物，它们必须把细胞“残忍地杀死”后才能进行观察。这样一来，生物学家就难以研究分子在活细胞中的正常活动。
于是，生物学家就得重新考虑如何研制出精度超越200纳米的光学显微镜。显然，按照传统的方法继续研究，那就是“钻牛角尖”了，到了必须换种思路来突破“绕射极限”。这种新思路还真被科学家想到了，那就是不再用外来的光源观察细胞，而是让细胞中的分子发出荧光来观察它们。因此，目前生物学家所用的超分辨率显微镜也叫荧光显微镜。
如何让细胞中的分子发出荧光呢？赫尔发明了荧光手电来解决这个问题。赫尔先利用成熟的分子染色技术给细胞注射荧光物质，荧光物质像染料一样沾染到细胞中的生物大分子上。然后，利用荧光手电发出极细的激光束照射生物大分子，大分子上的荧光物质被激发而发出荧光，就像是生物大分子本身发光一样。
突破极限
为何发出荧光的细胞就可以让光学显微镜突破极限呢？因为在周围环境黑暗的情况下，显微镜就可以看到细胞中发光的分子。有一个很好的例子可以说明这个问题。在明亮的白天，我们很难看到几百米外的一盏灯泡；如果是在漆黑的夜晚，这盏灯泡亮起来之后，我们就可以看到它了。
如果夜晚远处只有一盏灯，我们可以很好地分辨出这盏灯。如果夜晚远处有一大片灯，甚至有一座明亮的城市，我们就很难分辨其中的一盏灯，这是因为光线相互干扰，“阿贝原则”又起作用了。因此，赫尔得想办法消除光线干扰。他改进荧光手电，让它可以发出一束激光让生物分子发光，再用另一束激光消除其他荧光，通过两束激光交替扫描细胞，就可以“看清”生物中的大分子了。
莫尔纳尔和白兹格进一步想出了一些办法，消除或滤掉细胞中多余的荧光，结果让显微镜居然成功地“看到”单个的生物分子，这被称为单分子荧光显微镜。
活生生的纳米世界
诺贝尔化学奖评委会认为：“理论上讲，如今没有什么物质结构小得无法研究。”在电子显微镜时代，纳米世界就像沙漠一样一片死寂，其中的所有物质都静静地躺在那里。然而，超分辨率光学显微镜让我们可以看到活生生的纳米世界，所有的生物分子按照它们原本的“生活方式”继续活动，就像显微镜、荧光染料、激光这些东西不存在一样。
有了超分辨光学显微镜，科学家就可以从分子层面看到生命生老病死所带来的变化，为研究疾病机理和开发药物提供了一个新的视野。我们将是这些成果的最大受益者，因为这些成果可以更好地维护我们的健康。
中图分类号： O43 文献标识码： A 文章编号：
随着更小、更快、更高度集成的光学和电子设备的需求日益增加，存在许多具有挑战性的问题，在制造光学零件，例如，大尺寸，高数值孔径，大型非球面零件，对表面粗糙度、表面结构等要严格控制制造公差。三维测量不仅保证了光学产品的质量，也为制造过程的监测/控制提供了保障，是一项实用的技术。
1、微/纳米结构的三维测量
有多种技术可用于测量微/纳米结构，包括成像方法和非成象方法。每种方法都有其优点一方面，但也有缺点在另一方面。光学显微镜作为最经典的方法，具有快速和容易使用的特点。其中有些是可以执行具有高垂直分辨率的三维测量。然而，由于光的衍射性质，光学显微镜的横向分辨率也是有限的。使用高孔径物镜和光源更短的波长是一种有效的方式，以提高其横向分辨率。扫描电子显微镜具有很高的分辨率，在下降到1.5时，使用的电子能量小于1千电子伏。但是，它必须在真空中进行，也缺乏三维测量能力，有时还具有破坏性。电子光学测量系统由低电压的扫描电子显微镜中一个大的真空室和一个300毫米x-y定位阶段控制的真空激光干涉建立起来的，早在1998年就已经出现。散射测量能够快速用于直接测量，但是，它需要先进的数学建模工具和数据评估系统，以解决其存在的问题，其中的几何形状的三维结构是必备的知识。系统的概念是可变的和通用的，所以，可以执行许多不同类型的测量，例如，经典的散射仪，椭偏散射仪等。扫描探针显微镜技术允许直接测量三维形状的纳米结构，既具有高的横向和垂直分辨率，也不具有非破坏性。
1.1计量大范围显微镜
SPM通常有一个小的扫描范围内，一般为几十微米。这一方面极大地限制了其进一步的应用。为了延长测量量，以及提高校准能力，计量大范围原子力显微镜的出现使测量体积达到25mm×25mm×5mm。将待测量的样品沿z轴方向放置在2μm的z压电阶段。z压电阶段的延伸是由嵌入的电容式传感器具有亚纳米分辨率进行测量的。机械地安装在一个三维（3D）机械定位阶段的运动平台的z压电阶段，简称为纳米测量机。NMM的运动平台包括三个高精度的彼此正交的平面镜和一个反射镜角。三个嵌入式零差干涉仪是用来测量运动平台的位置相计量帧的，分辨率为0.08 nm。自制一种新的原子力显微镜头，被机械的固定在微晶玻璃柱上。三个干涉仪的测量光束的交点处位于悬臂尖端位置。在这种方式，测量原理得到满足。在NMM的z压电阶段的详细描述中也介绍了其他方面。
1.2层厚度的测量
涂层是一个重要的光学部件的制造过程。光层的厚度和均匀性，需要精确地测量/控制中。有多种技术可用于层厚度的测量，包括光学显微镜，反射计和椭圆仪。其中，椭偏仪的主要应用的方法之一是能够表征薄膜厚度的单层或复杂的多层。它可以实现极高的测量稳定性。然而，它的测量不确定度大，对系统会产生一定的误差，因此该仪器的校准是一个关键问题。
1.3侧壁结构的测量
光学结构的侧壁特性，可能会影响光学部件的性能。例如，在光波导和菲涅尔透镜，大型侧壁的粗糙度将导致高光散射造成的损失。侧壁结构的测量是比较困难的。尽管目前由多种显微技术弧测量微纳米结构，但是几乎所有的技术在侧壁测量时都会遇到问题。如图1示例，原子力显微镜（AFM）和触针的探针通常有一个尖与锥体或圆锥形状，在图1（a）中，触针永远不会靠近侧壁。在光学显微镜和电子显微镜下，图7（b）中由于在侧壁或侧壁之间存在多重反射的反射差导致测量比较困难。在以往，通常采用破坏性切割来测量结构的侧壁。
（a）原子显微镜和轮廓仪（b）光学显微镜和电子显微镜
图1 传统测量技术在测量侧壁中的遇到的问题
1.4未来纳米结构的三维测量
虽然大多数原子力显微镜结构提供完美的3D视图，但它们不是真正的3D测量仪器，这是由多种因素引起的。首先，几乎所有的原子力显微镜探针具有圆锥形或锥体形状，具有陡峭的侧壁，这是不能够测量三维形状的结构，如图1（a）所示。其次，正常的原子力显微镜适用于沿z轴的伺服回路保持的前端样品相互作用常数。在测量时可能会遇到困难，例如，垂直结构。第三，正常的原子力显微镜测量表面像素平等的横向距离。
2、形状计量
光学部件的形状误差的对光学系统的性能有着显著的影响作用。由于对光学系统对性能要求非常高，也使得光学部件的几何量计量变得越来越有难度。例如，在先进的光刻机或同步反射镜透镜的制造中，制造公差变低，甚至下降到纳米级。在这些光学制造过程中，越来越多的是减少光学像差和减少光学元件的数量，而不是球面透镜的非球面镜片强度。
在多种可计量形式中，光学干涉是最常用的计量方法之一。在它的配置中，从测量表面反射的波阵面与从参考反射镜反射的波阵面进行干涉。波阵面的差异也就是参考和测量表面的形式之间的差异，通过内插的干涉条纹可确定。迈克尔逊干涉仪或菲佐型强麦都比较适用。光学干涉有诸多的优点，如可以结合而为城乡对测量速度进行提高，不确定性低，操作简单等。采用2D光学干涉测量非球面结构时，如直接采用计算机产生全息图的剖面是，是一种广泛使用的仪器，用于测量光学零件的轮廓和形式。许多不同种类的传感器，包括非接触式光学传感器和手写笔传感器与干涉轮廓仪相比更加灵活，能够适用与不同形式的测量。
3、结束语
三维测量技术在实际应用过程中不仅保证了光学产品的质量，也为相关制造过程提供的监测/控制依据。本文介绍了一些三维测量的研究，以支持光学制造。计量大范围原子力显微镜，真正的3D原子力显微镜适用于多功能三维测量微/纳米结构。
参考文献
目的：利用激光共聚焦显微镜评价超声乳化白内障摘除术后角膜的活体组织学改变。方法：随机选择中国医科大学眼科医院30例欲行白内障摘除手术的患者进行超声乳化白内障摘除术。患者于手术前、术后1，7，30d；6mo，利用海德堡Retina Tomograph IIIRostock Cornea Module (HRTIII RCM)激光共聚焦显微镜对角膜各层细胞及神经进行形态学分析。结果：形态学观察发现角膜上皮细胞和前基质细胞在术后无明显改变。角膜基质神经纤维呈不规则的节段状改变，在术后第7d最为显著。中基质及后基质层的角膜细胞同术前相比反射更为明显。角膜内皮细胞的细胞核和细胞质肿胀。结论：超声乳化白内障摘除手术对角膜组织有一定的影响，导致细胞和组织形态的改变，但这些改变是可逆的。
【关键词】 超声乳化白内障手术；角膜；组织学
Abstract AIM:To define the microscopic cornea changes with in vivo laser scanning confocal microscopy after phacoemulsification.METHODS: Thirty eyes were assigned to undergo cataract extraction by ultrasonic phacoemulsification in China Medical University. The morphologies of corneal layer by layer were evaluated in vivo with the Heidelberg Retina Tomograph IIIRostock Cornea Module (HRTIII RCM) confocal microscope pre and postoperation for up to six months.RESULTS: For morphology， some irregular segments of nerve fiber were most pronounced seven days postoperation. Stroma keratocytes were obvious compared with the preoperative condition. Corneal endothelial cells become obviously swollen in both the cytoplasm and nucleus. At six months， corneal cell and nerve morphology recovered to normal.CONCLUSION: Microstructural abnormalities were identified at each level of the cornea recovery process after phacoemulsification and lead to corneal morphology changes， but these could be recovered to normal in six months.
KEYWORDS: phacoemulsification; cornea; histology
0 引言
超声乳化白内障吸除术最主要的优点是减小手术切口、减轻组织损伤、使患者视力更快恢复。现代白内障手术技术的进步将手术引起的散光和炎症降到最低，术后视力恢复快［1］。而角膜水肿成为影响术后视力恢复的主要因素。在过去围绕术后角膜并发症的研究多集中在角膜内皮失代偿和观察内皮细胞改变上（例如细胞数、密度和/或形态）［24］。目前还没有活体角膜各层组织改变的观察。新一代海德堡激光共焦显微镜的角膜模块，可以提供高分辨率的眼表组织图像，使我们能够活体动态观察角膜组织改变和角膜界面的形态［5］，分析超声乳化白内障吸除术后角膜组织的改变。我们利用该设备观察超声乳化白内障摘除术后6mo内角膜的组织学改变，包括：角膜上皮细胞、角膜上皮下神经纤维、角膜基质神经纤维束、角膜基质细胞、角膜内皮细胞等。
1 对象和方法
1.1 对象
我们随机选取200609/200704我院行年龄相关性白内障吸除术的患者25例30眼，男13例，女12例，平均年龄57.8（52±6.7）岁。纳入标准：散瞳后瞳孔≥7mm，图1 A：术前角膜上皮细胞为大小不一的多角形细胞镶嵌在一起，部分细胞可见细胞核；B：术后第1d部分患者出现片状的翼状细胞边界消失；C：术前角膜神经纤维；D：术后第7d神经纤维呈不规则的节段状；E：正常角膜前弹力层的朗格汉斯细胞；F：手术后朗格汉斯细胞形态没有变化；G：术前基质层的神经纤维；H：术后1mo两例患者出现基质神经不规则弯曲和串珠状改变。
角膜内皮细胞计数＞2000 个/mm2。排除标准：患有眼部其他疾病或影响角膜恢复的全身疾患，如：角膜病变、青光眼、葡萄膜炎、干眼或有内眼手术史、系统疾病如：糖尿病。
1.2 方法
常规术前检查，包括视力检查，双眼裸眼远近视力(UCVA)和最佳矫正远近视力(BCVA)；裂隙灯显微镜检查角膜、前房、晶状体混浊程度；眼底检查；眼压；角膜内皮细胞检查；B超；屈光状态(自动验光仪等)及生物学测量(A超、IOL Master等)测量眼轴长度等。全部手术由同一位有经验的术者进行。使用Infiniti超声乳化仪(Alcon， USA)，全部患者术前接受5g/L盐酸丙美卡因滴眼液(Alcaine， Alcon， USA)表面麻醉，3.0mm透明角膜切口，3g/L透明质酸钠与40g/L硫酸软骨素(Viscoat)（Alcon， USA）保护角膜内皮。行5.5～6.0mm连续环形撕囊，白内障超声乳化吸除，负压500mmHg、流量35mL/min，瓶高95cm。囊内植入Acrysof SN60AT或SA60AT人工晶状体(Alcon， USA)，I/A吸除黏弹剂。术后自第1d起给予典必殊滴眼液3次/眼，疗程4wk，全部患者无术中或术后并发症。利用最新的HRT Ⅲ/RCM共焦显微镜检查全部患者，HRT Ⅲ纵向分辨率约1μm，可以实现活体角膜各层的图2 A：角膜基质；B：术后1mo内，前基质层细胞形态未见明显变化；C：术前的中基质层细胞；D：手术后角膜中基质细胞形态无明显改变；E：手术前后层基质细胞；F：手术后后基质细胞层细胞反射明显且细胞明显肿胀；G：角膜内皮细胞；H：术后1mo的角膜内皮细胞数明显下降，细胞明显肿胀，失去六角形外形而变得不规则，细胞核清晰可见。
研究［5，6］。HRT Ⅲ/RCM的激光光源使用波长670nm的二极管激光。进行活体共焦显微镜检查前，于结膜囊下穹窿部滴1滴5g/L盐酸丙美卡因滴眼液和1滴凝胶型人工泪液2g/L卡波姆（Bausch & Lomb， US）。检查在矢状轴进行，因此检查时，能够精确显示角膜各层结构。对全部患者进行中央角膜各层采集，每个患者在同一检查层面至少采集5张共焦显微镜图片。每眼的检查时间
2 结果
2.1 角膜上皮
术后1mo中央角膜上皮形态无明显改变。术前角膜上皮细胞为大小不一的多角形细胞镶嵌在一起，部分细胞可见细胞核（图1A）。有8例在术后第1d出现片状的翼状细胞边界消失（图1B），在第3d恢复。
2.2 角膜神经纤维
角膜神经纤维位于前弹力层和基底上皮细胞之间。术前可见角膜神经呈清晰的、反射均一的线状结构。局部还观察到一些树枝状或细小神经纤维束(图1C)。手术后神经纤维呈不规则的节段状，于术后第7d最明显(图1D)。部分神经纤维出现异常分支，断续排列，主干神经纤维增粗、弯曲，反射强弱不均。术后30d尚未恢复，于术后6mo形态恢复正常。
2.3 前弹力层和朗格汉斯细胞
在正常角膜，前弹力层为无定形的均一的间质层。Patel和McGhee研究发现出现于前弹力层的细胞称为朗格汉斯细胞［6］。本研究观察到手术前朗格汉斯细胞表现为亮的细胞微粒和无突起的细胞体，或细胞树突（图1E）。手术后细胞形态没有变化（图1F）。
2.4 角膜基质层的神经纤维
基质层的神经纤维位于前部和中间基质层之间。术前基质层的神经纤维为粗的、高反射、直线性结构（图1G）。术后1mo，有两例患者出现基质神经不规则弯曲和串珠状改变（图1H）。
2.5 角膜基质
前基质细胞界限清晰、高反射、细胞核呈卵圆形，位于不同位置 （图2A）。在术后1mo内，前基质层细胞形态未见明显变化（图2B）。中基质层细胞为规则的椭圆形，较前基质层细胞密度低（图2C）。手术后角膜中基质细胞形态无明显改变，但细胞较术前反射高（图2D）。手术前，后层基质细胞较前基质层细胞圆（图2E），手术后，后基质细胞层细胞反射明显，且细胞明显肿胀（图2F），至术后6mo恢复。
2.6 角膜内皮细胞
术前角膜内皮细胞呈规则排列的六角形细胞，细胞体高反射、细胞边界低反射，细胞核不明显（图2G）。术后角膜内皮细胞数明显下降，细胞明显肿胀，失去六角形外形而变得不规则，细胞核清晰可见，至术后1mo未恢复（图2H），手术后6mo细胞形态恢复正常，但仍然可见细胞核。
3 讨论
与白内障囊外摘除手术（ECCE）相比，超声乳化白内障吸除术最主要的优点是减轻组织损伤、使视力更快恢复，但是仍然存在术后并发症。研究表明白内障手术后内皮细胞数降低和术后角膜水肿与超声乳化白内障吸除术后角膜内皮细胞的丢失有着密切的关系［7］。目前对术后角膜并发症的研究集中在角膜内皮细胞丢失和角膜厚度方面，其检测设备有角膜厚度测量仪、非接触式角膜内皮镜等，但观察活体角膜各层修复过程的检查方法十分有限。最近活体激光共焦显微镜开始在实验室和临床应用。它可以实现对角膜显微结构更详细的逐层观察，能够提供眼表的高分辨率图像，以供观察角膜组织的改变。
我们利用活体激光共聚焦显微镜观察了超声乳化白内障吸除术后角膜各层的改变。至术后1mo，大部分病例与术前比较，中央角膜上皮细胞的形态无明显变化。部分病例表现为术后第1d翼状细胞边界不清，3d后恢复。在角膜神经方面，我们观察到一些纤维节段不规则增粗。与术前比较，一些神经纤维出现中断、更加迂曲等改变。角膜基质层可以观察到术后角膜基质细胞水肿和细胞密度降低，这种现象多出现于角膜后基质层。对于角膜内皮细胞，与术前比较出现显著的内皮细胞密度减低，且有统计学意义。术后内皮细胞及细胞核水肿明显，至术后6mo细胞形态才恢复正常。以上各层角膜组织的形态改变在术后6mo的复查中均恢复了正常。
根据对术后角膜情况的观察，我们将白内障手术中可能影响角膜的因素归纳为以下4类：（1）对角膜内皮的直接机械损伤包括：切口和手术过程中晶状体碎屑、器械或人工晶状体（IOL）接触角膜；（2）灌注液的影响（化学成分、流速、湍流、渗透压）［810］；（3）超声乳化能够在前房产生羟基，引起组织损伤；（4）针头在切口内前后运动，金属针头振荡压迫袖套，使温度升高引起热损伤。
尽管超声乳化白内障摘除术后利用激光共聚焦显微镜可以观察到角膜组织在显微结构上存在一定的异常改变，但这些损伤在术后很快就能恢复。将来对于各层细胞还应进一步进行定量分析，以指导临床医生对白内障术后角膜恢复过程的全面了解。
参考文献
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与传统尿红细胞检测方法相比， HT-2000尿沉渣分析仪具有检测速度快、精密度高以及重复性好等显著优势， 能够有效缓解因工作人员短缺而无菌尿液标本数量大所带来的工作压力， 解决了尿沉渣分析无法标准化的重大难题 。均一性与非均一性尿红细胞检测能够对肾性与非肾性血尿诊断产生重要的影响 。本次研究收集2014年5月～2015年5月送检住院患者的无菌尿液3000份， 使用HT-2000尿沉渣分析仪检测尿红细胞时结合光学显微镜进行检测， 有效提高了检测准确性， 现报告如下。
1 资料与方法
1. 1 一般资料 选取辽宁省义县人民医院2014年5月～ 2015年5月送检住院患者的无菌尿液3000份， 标本于采集后2 h内完成。仪器与试剂：HT-2000尿沉渣分析仪、质控品与配套试剂， 普通光学显微镜， 刻度离心管与水平离心机。
1. 2 方法 将收集到的无菌尿液样本进行混合， 搅匀后分装入两支管中， 每管各10 ml， 采用双盲法进行操作。其中一管采用HT-2000尿沉渣分析仪进行检测， 另一管首先1500 r/min， 离心5 min， 再弃掉上清液， 沉渣后使用光学显微镜进行检测， 2 h内完成检测。
1. 3 判断标准 HT-2000尿沉渣分析仪标准：红细胞每微升>24个， 则为检出阳性。光学显微镜标准：每高倍视野红细胞>3个， 反之则是阴性结果， 对两种方法的红细胞阳性率与HT-2000尿沉渣分析仪检测红细胞的假阳性率进行计算。
2 结果
3000份无菌尿液标本中， HT-2000尿沉渣分析仪检测结果显示阳性663例， 阳性率为22.1%；光学显微镜检测结果显示沉渣分析仪无漏诊， 仅有误诊， 阳性524例， 假阳性139例， 阳性率为17.5%， 假阳性率为5.6%。139例假阳性无菌尿液样本中， 有酵母菌11例， 占7.9%， 有细菌56例， 占40.3%， 结晶68例， 占48.9%， 其他因素4例， 占2.9%。见表1。
3 讨论
尿沉渣就是尿液中的有形状成分， 是原尿经过离心后， 形成的沉渣， 是尿液有形成分质和量的组合， 包括细胞、管形、结晶、细菌、等各种有形成分， 因此， 尿沉淀检测可以准确判定泌尿系统疾病的具体发病部位， 还可以实现对疾病诊断、鉴别诊断与预后的判断。此外， 应注意的是患者采尿后应该迅速地进行检测， 否则放置时间过长， 如果是低张尿可出现溶血；如果是高张尿有可能出现脱水而使红细胞形状发生变化；如果是碱性尿可使血细胞成分和管型崩坏， 影响检验的准确性 。
尿沉淀检测可以发现实验室检查过程中难以检测到的异常情况[1-3]。因为尿沉淀检测有着非常高的准确性， 所以在临床中规范尿沉淀检测的操作与检测是十分必要的。尿沉淀检测中最为重要的指标是尿红细胞：在肾脏病诊断、病情发展以及预后判断中， 尿红细胞检测有着非常重要的意义， 对红细胞进行定量分析是对其临床意义进行研究的关键所在[4-6]。HT-2000尿沉渣分析仪对红细胞进行检测， 结果显示假阳性比较少， 在用于标本量较大的实验室中时能够有效提升工作效率。
当前， 尿沉淀分析检测采用的主要方法有干化学法、显微镜检测法以及流式尿液检测法等。HT-2000尿沉渣分析仪在检测不同项目采用不同的双波长测定试纸块颜色变化， 以鉴别尿液样本中的有形成分。因为HT-2000尿沉渣分析仪具有图形直观、操作简便、结果值稳定以及检测速度快等特点， 所以在临床中的应用非常广泛。
HT-2000尿沉渣分析仪的主要工作机理是采用冷光源积分球检测技术， 报告结晶、上皮细胞、细菌、红细胞与白细胞等有形成分。但是尿液中的有形成分较为相似， 且尿液中成分非常复杂， 各项检测指标与检测项目中因染色、杂质等因素有存在一定相似性。此外HT-2000尿沉渣分析仪在检测过程中会受到一定限制， 从而使检测结果有一定的偏差。比如UF-100尿沉渣分析仪就无法有效识别药物结晶成分、脂肪滴以及肿瘤细胞等物质， 同时也无法识别红细胞的病理类型及形态[7， 8]。所以， 如果患者尿液中存有大量细菌成分或结晶成分时， 会影响到红细胞的测定， 导致假阳性结果的发生， 进而影响到患者疾病的诊断。
本次研究收集2014年5月～2015年5月送检住院患者的无菌尿液3000份， HT-2000尿沉渣分析仪检测结果显示阳性663例， 阳性率为22.1%；光学显微镜检测结果显示沉渣分析仪无漏诊， 仅有误诊， 阳性524例， 假阳性139例， 阳性率为17.5%， 假阳性率为5.6%。139例假阳性无菌尿液样本中， 有酵母菌11例， 占7.9%， 有细菌56例， 占40.3%， 结晶68例， 占48.9%， 其他因素4例， 占2.9%。对HT-2000尿沉渣分析仪检测红细胞显示为阳性， 需要再接受镜检复查， 避免发生临床误诊。诸多学者与专家也曾建议， 对尿液进行分析时， 最好采用干化学法联合尿沉渣自动分析仪共同进行筛查， 并对尿沉渣全自动分析仪提示类酵母菌、项目结晶、病例管型阳性以及细菌计数过高的标本和肾病患者的标本， 同时结合显微镜检测， 能够有效提升尿液标本的检验质量 。
综上所述， 使用HT-2000尿沉渣分析仪检测尿红细胞时结合光学显微镜进行检测， 能够有效提高检测的准确性， 值得在临床中进一步推广应用。
参考文献
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1.1金刚石自支撑膜的制备本实验采用自制的30kW直流电弧等离子体喷射设备。衬底为直径65mm的钼片，沉积前先用金刚石粉对钼片表面进行研磨处理提高形核密度，然后用酒精超声清洗。沉积条件为：Ar/H2/C3H8混合气体,其中C3H8的体积分数1%，输入功率17kW，反应压力4.5kPa，沉积时间62h，薄膜沉积厚度700μm~800μm。采用机械方法对金刚石薄膜形核面和生长面进行双面抛光，抛光后薄膜厚度在450μm左右，薄膜表面粗糙度Ra＜30nm。
1.2金刚石薄膜“黑色组织”表征
利用光学显微镜对抛光前后的膜进行透射光、反射光以及侧入射光模式的观察，利用X射线光电子能谱（XPS）和拉曼光谱（Raman）对黑色组织成分进行表征。
2结果与讨论
图1是样品抛光前后的光学显微镜对比图。图A、B是抛光前在高倍光学显微镜下观察某特定晶粒的显微图，由于生长面晶粒尺寸较大，光学显微镜景深很小，所以光学显微镜视场下除了焦平面，其余视场成像模糊。A图是反射光成像，中间最明亮的大三角形即为（111）结晶面。晶面表面不是完全平滑的，有很多缺陷，中间表面“断裂”部分尤其明显。在反射光下，“断裂”部分表现为黑色的粗线，其余表面相对平滑，反射光下黑色区域不明显。当采用透射光时，（111）结晶面除原反射光下显示的黑色区域外，黑色区域面积增大了。该区域边缘模糊，深浅不一，占了晶面的大部分区域，但是这些黑色区域的范围都在（111）晶面的晶界内部，这些增加的黑影即为晶粒内部“黑色缺陷”在晶粒表面形成的投影，“黑色缺陷”降低了薄膜的光学透过率。陷主要有两种显示形式：一种为团絮状黑斑。这种团絮状黑斑在视场中有两块，且它们集中分布区域的形状与晶粒轮廓大致吻合，对比图B，可以推断图中上下两个大黑斑处于两个大晶粒内部，这两个晶粒中的黑色缺陷明显多于其他区域。很多文献报道[9~11]，（111）面容易出现位错、孪晶等缺陷，这和图1中我们的观察结果一致。而且在抛光的过程中，（111）面很容易出现一些凹坑，这也说明（111）面存在一些缺陷导致晶粒在抛光过程中会出现“局部破碎”现象。这些证据都表明晶粒内部的一些缺陷影响了光的透射，形成了黑色缺陷，从而降低了金刚石膜的光学性能。
目的：探讨利用荧光显微技术对黎族药物大青进行显微鉴别的可行性，并为建立大青药物质量标准提供科学依据。方法：利用研究级正置荧光显微镜对未经试剂处理的大青茎粉末和新鲜叶片进行观察，并拍照。结果：大青茎粉末中主要含有3种类型的纤维，还含有木栓细胞、网状导管、方晶、腺毛和非腺毛、钟乳体，且图像清晰。更特别的是在表皮细胞中还含有铜钱状的物质及一圈荧光存在于皮层中。在叶片下表皮中气孔数较多，角质层细胞波纹状、还有钟乳体、2细胞的腺毛、非腺毛等结构。结论：利用荧光显微镜鉴别生药粉末，操作简便，图像直观，值得开发利用。在叶片鉴别方面角质层、腺毛等结构清晰可辩，可代替扫描电子显微镜，但是还需结合普通光学显微镜来确定气孔的类型。
【关键词】 荧光显微镜；大青；黎族药物；显微鉴定
［ABSTRACT］ Objective: To explore the feasibility of fluorescence microscopic technique in the identification of Clerodendrum cyrtophyllum used in Li medicine and to collect scientific evidence for the development of its quality standards. Methods： The stem powder without reagent and fresh leaves of Clerodendrum cyrtophyllum were observed and photographed under fluorescent microscopy. Results：Under fluorescent microscopy， it was clearly shown that stem powder of Clerodendrum cyrtophyllum was mainly consisted of 3 types of fiber， cork cells， mesh tube， square crystal， glandular， non glandular and cystolith. More specifically， there were coinlike substances in the epidermis， a fluorescent ring in the cortex. Many stomata in the lower epidermis with ripplelike cuticle cells， cystolith， 2 cells glandular hairs， nonglandular hairs were shown in the fresh leaves images. Conclusions：It is feasible to use fluorescence microscopic technique in the identification of stem powder of Clerodendrum cyrtophyllum and the cuticle cells and glandular hairs in fresh leaves， but light microscope is also needed for the identification of stomata types.
［KEY WORDS］ Fluorescence microscopy; Clerodendrum cyrtophyllum; Li medicine; Microscopic identification
黎族药物大青来源于马鞭草科植物大青Clerodendrum cyrtophyllum Turcz.， 其根、茎、叶入药，夏秋季采收，洗净，鲜用。长期以来在华南地区常代替板蓝根使用［1-3］。其黎药名为雅枫能，茎叶入药，具有清热解毒的功效［4］。前人已对其根、茎的横切片显微结构进行了研究，但是对茎粉末结构的研究未见报道，在叶结构方面，也未见有研究报道［5］。另外，以往研究均利用普通光学显微镜，均需用试剂处理，才能观察，并需一定的绘图机能。在荧光技术方面，以往的荧光分析技术需将有效成分用试剂提取后才能在荧光分光光度计下测量其荧光光谱［6，7］，操作较麻烦。在叶片研究方面有报道认为利用荧光显微镜可观察气孔形状，但不知对叶片其他结构形态是否有效［8］，因此，在本研究中通过尝试对未经试剂处理的生药粉末和新鲜叶片在荧光显微镜下，进行观察，以探讨利用荧光显微技术进行生药显微鉴定的可行性，为开拓一种简便有效的显微鉴定方法，同时为黎族药物大青质量标准的建立及开发黎药提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
马鞭草科植物大青Clerodendrum cyrtophyllum Turcz.， 从海南医学院黎族药用植物观赏园采集，将其茎去掉叶片后晒干粉碎，取其粉末作为试验材料。另外在实验前夕取成熟大青叶片一块，冲洗干净晾干备用。所用仪器为研究级正置荧光显微镜（Olympus BX51）。
1.2 方法
在研究级正置荧光显微镜（Olympus BX51）的自然光下找到大青茎粉末观察目标，再关上光栅，在荧光下观察，并拍照。从备用大青叶片中间剪取2mm×2mm的叶块，背面朝上置于载玻片盖上盖玻片后，同样先在自然光下找到观察目标，再关上光栅，在荧光下观察，并拍照。
2 结果
2.1 大青茎粉末观察结果
粉末淡黄色，含有的纤维主要有3种，即X形，L形和分叉状等纤维（图1A～C），木栓细胞表面观四边形，排列较整齐（图1D），晶鞘纤维含量丰富，里面同样含有很多数量的方晶（图1E）。导管多破碎，多为网纹导管（图1F～G），在粉末中含有钟乳体、石细胞（图1H～I），在木部薄壁细胞可看到一圈绿色的荧光，很快消失。在粉末中含有一定数量的非腺毛和腺毛（图1J～K），值得注意的是在表皮细胞中还有许多铜钱状的分泌组织（图1L）。
2.2 大青新鲜叶观察结果
大青叶下表皮浅绿色，在荧光显微镜下其角质层细胞垂周壁波状或深波状弯曲（图1M），在叶表皮中可以看到存在钟乳体（图1N），单位面积上气孔数量较多，同时也存在较多2细胞的腺毛，及少量非腺毛（图1O）。
3 讨论
3.1 大青茎粉末结构与大青茎横切片结构比较
据文献报道［3］， 大青茎（径约5mm）之横切面，最外缘表皮细胞，散见非腺毛；皮层韧皮纤维与石细胞，多个连生，排列成环，强木化，形成层，2～3层，细胞小，呈类长方形或扁长方形。木质部，由导管、木部薄壁细胞、髓线所组成，导管单个或2～4个连生，主要为网纹导管；髓线细胞呈类长方形、类方形及扁长方形；木部薄壁细胞，与导管伴生，细胞呈类长方形、类方形及扁长方形。中央为髓部，散见石细胞及草酸钙方晶。
本组研究中，大青粉末除含有上述非腺毛、石细胞、方晶、导管、纤维外还具有少数腺毛和钟乳体，而钟乳体是马鞭草科植物的一个显著特征。另外纤维的种类也较丰富，因此粉末研究是生药显微研究中不可缺少的内容。由于大青在华南地区分布比较广泛，但不同地区其有效成分的含量有所不同，其有效成分的含量高低直接影响其治疗效果，而在荧光显微镜下可在木部薄壁细胞观察到一圈显著的绿色荧光，这可能是大青茎有效成分的存在部位，根据其荧光强度的不同可比较来源于不同地区的大青茎质量的优劣。
3.2 不同显微镜观察大青茎粉末结构效果的比较
以往对生药粉末形态观察一般先采用水合氯醛透化，稀甘油装片后再在普通光学显微镜观察，由于受稀甘油等试剂的影响，观察效果不是较理想，且观察的结构形态一般平面状态；但是在荧光显微镜下操作步骤简便，生药不须试剂处理，可直接用粉末装片观察，由于无甘油等试剂干扰影响，其视野洁静，结构层次感较强。如所观察的晶纤维、木栓细胞等，因此，整体效果要优于普通光学显微镜。更重要的是，在荧光显微镜下，有些结构可发出荧光，如大青茎粉末含有的不同纤维发出的荧光及亮度不一样，为我们鉴别不同种类的生药提供了重要的依据。
3.3 不同显微镜观察大青新鲜叶结构效果的比较
在荧光显微镜下观察新鲜大青叶片的下表皮，能够清晰地观察到气孔的数量及腺毛、非腺毛，其次在叶片上观察到其存在着一定数量的钟乳体，立体状的波纹状角质层细胞也很容易观察，另外可清晰地看到气孔的开合状态，在一定程度上利用荧光显微镜可代替扫描电子显微镜观察上述叶片结构。关于气孔类型，已有的关于马鞭草科气孔的观察研究通过解离染色方法证明该科中气孔类型较为丰富，有直轴式、平周式、不定式等［5］，但在荧光显微镜下叶片气孔的类型不好判别，因此其有一定缺陷，而据我们在光学显微镜下将大青叶下表皮撕裂后加蒸馏水后观察，大青叶气孔类型很容易就能被判断为无规则形，因此判别叶片气孔的类型还需利用将下表皮撕裂或解离后等方法再在普通光学显微镜观察才方便。
近年来，随着新技术的不断涌现，迅速地推动了中药或生药鉴定的发展［9，10］，关于生药显微鉴别仪器，常见的有普通光学显微镜、偏振光显微镜、扫描电子显微镜等，利用荧光显微镜进行化学成分组织定位也有报道［11］，但最常见的仪器是光学显微镜，在鉴别生药方面荧光显微镜的使用还未见报道。我们利用荧光显微镜观察黎族药物大青茎粉末和新鲜叶片显微构造是一次成功的尝试，它为生药显微鉴定开拓了一条新的途径，且操作简便，无须任何试剂处理，保留了生药的原样，图像更加直观、清晰，值得深入研究。但也需要注意，有些部位荧光消失较快，需快速观察。本组资料只探讨了定性实验问题，其他涉及到如何对化学成分进行定量等问题还需继续探讨，但是至少我们知道化学成分存在的部位，这为我们继续改进实验提供了契机。由于本次研究材料中无淀粉粒结构，其结构在荧光显微镜下效果如何？有待下次在其他材料中研究。
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中图分类号 TH7 文献标识码 A 文章编号 1674-6708（2016）166-0148-02
20世纪80年代以来，我国光学显微镜的设计发生了很大的进展，在其制作上，越来越注重实用性。为了改进光学显微镜的多功能方面，采用组合方式的装配设计集普通光镜加相差、暗视野、荧光、DIC、摄影装置于一体，使光学显微镜在使用中操作方便且灵活[1]。倒置显微镜与此原理相同，也是结合其他技术达到使用功能的目的，根据倒置显微镜的用途可以分为生物倒置显微镜、偏光倒置显微镜、金相倒置显微镜、荧光倒置显微镜等种类，从而在诸多领域被广泛使用。根据其使用功能特点，我们可以看出倒置显微镜技术具有极其宽阔的发展前景。
1 倒置显微镜技术的原理和具体操作
1.1 倒置显微镜技术的结构原理
倒置显微镜的结构主要由机械、光学和照明3个部分组成，每部分的功能组成都不相同，接下来我们将对其进行详细介绍。
首先，在机械部分，与普通光学显微镜相似，主要有镜座、镜臂、观察镜筒、物镜转换器、载物台以及调节器（包括粗螺旋和细螺旋）组成，在倒置显微镜中有着不用的功能作用，例如，镜座是用以支持整个镜体的一个底座；镜臂是在取放显微镜的时候用来手握的部位；物镜转换器是可以调换不同倍数物镜的结构；载物台用以放置玻片标本；调节器是调节标本与物镜相对位置的装置。
然后，光学部分主要包括目镜和物镜。区别于正置显微镜的是，倒置显微镜的物镜在观察用品的下方，有4～6个，其中，刻有“10×”符号的物镜较短，为低倍镜，刻有“40×”符号的较长，为高倍镜，最长的是刻有“100×”符号的油镜[2]。而且，在油镜和高倍镜上经常会有一圈颜色不同的线，以示区别。目镜装在镜筒的上端，目镜上面分别刻有5×、10×、15×，表示其放大倍数，10×的目镜较为常用。另外，显微镜的放大倍数是目镜放大倍数和物镜放大倍数的乘积，如物镜为10×，目镜为15×，其放大倍数就为10×15=150。
最后，照明部分分为透反射2种，透射式照明在载物台的上方，提供明场、相衬、诺马斯基干涉相衬等显微术的照明；反射式照明安装在物镜的下方，提供荧光观察、金相的明暗场观察、偏振光观察等；随着高分辨成像技术的发展，研究级的倒置显微镜还配置了3～4个的外接照明端口，用于激光共聚焦、荧光漂白后恢复等模块照明；通常倒置显微镜的照明系统均采用科勒照明，使均匀度达到80%以上。聚光器（集光器）的主要作用则是光线集中于所要观察的标本上，其由聚光镜和光圈2部分组成，位于镜台下方的集光器架上[3]。
1.2 倒置显微镜技术的具体操作
在倒置显微镜操作中，最常用的观察方法是相差。这种方法在观察活细胞和微生物的时候不需要染色，是一种比较理想的观察方法。在此基础上，提供各种聚光器来满足需要，可以观察到具有高对比度和对比度的自然背景颜色图像。以下我们叙述一下倒置显微镜的具体操作流程。首先接连电源开机，打开镜体下方的电控开关。在使用的之前，先把要观察的对象放在载物台上，转动转换器，选择物镜，然后进行观察，调节铰链式双目目镜到舒适的状态为止，接下来开始推拉调节镜下的亮度调节器至适宜光源状态，再调节聚光镜下面的光阑，调节光源大小。下一步是调节像距，即转动物镜转换器选择合适倍数的物镜和目镜的同时，调节升降来减小或消除图像周围的光晕，从而提高图像的衬度。下一步就可以直接通过目镜进行观察了，在观察过程中可以调整载物台，选择想要观察视野。最后一步是关机：取下观察对象，使用光源亮度调节器把光线调至最暗；然后关闭镜体下方开关，断开电源，转动物镜转换器，把物镜镜片置于载物台下侧。
2 倒置显微镜技术的主要特点和应用
2.1 倒置显微镜技术的主要特点
根据倒置显微镜的结构分析和具体操作，我们可以发现倒置显微镜组成与普通显微镜相似，但其物镜与照明系统颠倒，倒置显微镜在观察培养的活细胞的时候，具有相差物镜。倒置显微镜和放大镜起的作用是相同的，就是把近处的一个微小物体放大成一个在人眼视力中清晰的图像，但是，倒置显微镜比放大镜的放大率更高。除了此特点，倒置显微镜的发展趋势逐渐与光电转换技术、计算机成像技术等技术结合，在使用中越来越方便灵活。根据其用途可以分为生物倒置显微镜、偏光倒置显微镜、金相倒置显微镜、荧光倒置显微镜等种类，在生物学、医疗科研等领域具有广泛的应用价值。
2.2 倒置显微镜技术的主要应用
倒置显微镜种类较多，根据目镜类别可分为单目倒置显微镜、双目倒置显微镜和三目倒置显微镜，其中三目倒置显微镜的构造中，除了用于双眼观察的两目，还有一目可以用来外接数码相机或计算机，从而组成数码相型倒置显微镜、电脑型倒置显微镜，而电脑型倒置显微镜可以分为生物倒置显微镜和金相倒置显微镜，根据其不同构造发挥的功能，不同的倒置显微镜应用的领域也有所不同。以倒置生物显微镜和金相倒置显微镜为例，倒置生物显微镜适用于生物领域，可以用来观察细菌以及活体组织培养、生物切片、流质沉淀以及其他透明或者半透明物体、粉末、细小颗粒等物体，与普通生物显微镜相比较，倒置生物显微镜对附着培养皿底部和悬浮培养基中的活体物质具有高效的观察功能，另外，倒置生物显微镜在食品检验、水质鉴定、晶体结构分析及化学反应沉淀物分析等领域也能发挥巨大作用。金相倒置显微镜的物镜在工作台下方，在使用金相倒置显微镜的时候不需要考虑所观察物体非观察面的平整情况，并且由于倒置的结构，工作台面的上方比较空旷，也不用考虑所观察物体的高低大小[4]。因此，金相倒置显微镜在金属材料以及其它固体块状物体的工业企业研究中应用广泛。不过，在工作台下方的镜头十分容易沉积灰尘，因此金相倒置显微镜使用者需要勤加保养，以免由于镜头的污渍影响观察效果。
3 倒置显微镜技术的发展趋势
综合以上对倒置显微镜的结构特点和主要应用来分析，我们可以看出倒置显微镜能够供高校科研实验、医疗卫生单位等部门使用，可以用于细胞、微生物、细菌、组织培养、沉淀物、悬浮体等的观察，能够连续观察并拍摄记录细菌等生物在培养液中繁殖分裂的过程，在免疫学、细胞学、遗传工程学、肿瘤学、寄生虫学、工业微生物学、植物学等各个领域发挥十分重要的作用。接下来我们将根据倒置显微镜技术的具体应用情况，可以看出倒置显微镜技术的发展趋势主要体现在倒置显微镜本身仪器精化、计算机系统应用于倒置显微镜技术和样品制作方法3个方向，接下来我们将分析倒置显微镜技术在这3个方向的具体进程。
首先，在倒置显微镜仪器本身方面，可以将单一功能的仪器逐渐发展为多功能组合的大型仪器，提高仪器的使用效率，并且不断精化各个部件仪器，有效提高其分辨率，能够使倒置显微镜技术在实际应用中能够观察到更加精细的结构，推进微观生物学的发展。其次，关于计算机技术与倒置显微镜技术相结合的方向，可以使科研能够和信息时代的发展接轨，将计算机技术与倒置显微镜技术有效结合，促进仪器的操作技术准确化和科学化，促进图像分析技术高度自动化，在方便倒置显微镜技术操作的同时，使倒置显微镜技术能够更具有实用性和灵活性。最后，在样品制作方面，要严格规范样品制作的过程和环境，研制出特殊环境的样品室和超高压倒置显微镜，使用科学有效的方法，使研究的生物能够在自然环境下完成动态过程，并观察到自然状态下的生物形貌，提高观察研究成果的质量和效率。除此之外，在对倒置显微镜的保养方面，一定要注重各个零件构造的清洁和养护，以保证仪器的使用性能，从而延长显微镜的使用寿命。
1674年，列文？虎克研制发明出来了第一台光学显微镜，从此以后，显微镜成为了人们观测微观世界的必不可少的工具，在各个学科领域中得到广泛的应用并发挥了巨大的作用。随着科技的发展和社会的进步，为了满足各个领域科研对显微镜的需求，倒置显微镜技术作为一种新型的显微镜操作技术在各个科学领域应用后受到了极大的推崇。科学是没有止境的，伴随着倒置显微镜技术在生命科学教学、科研、医疗研究等方面的推广，倒置显微镜技术会逐渐趋向成熟，使其在实际使用中更加方便灵活，具有更大的实用性和使用价值。
参考文献
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白血病是造血干细胞克隆性疾病，是一组高度异质性的恶性白血病，严重威胁着人们的身体健康。急性白血病因分型不同，采用的治疗方案也不同，疗效和预后也不同[1]。急性白血病的诊断除依据临床症状体征与血象外，骨髓细胞形态学检验是诊断急性白血病的主要依据和必要检查。但是由于多种原因，导致白血病漏诊、误诊的现象时有发生。因此本文通过多媒体显微成像技术在骨髓细胞学检验中的应用，提高急性白血病的正确分型，从而更好的为白血病的诊断、确定治疗方案、判断预后、观察疗效服务。
1 对象与方法
1.1对象：选取56例临床患者的骨髓片及外周血涂片进行观察。器材：大众世纪dz-510多媒体显微成像仪；xsp-2ca双目普通显微镜;瑞氏-姬姆萨复合染液；玻片等。
1.2 方法：（1）骨髓涂片：取有骨髓小粒部分，制备厚薄适宜、染色良好的骨髓涂片，同时做外周血涂片。（2）染色：采用瑞氏-姬姆萨复合染液进行骨髓涂片染色。（3）显微镜检查：严格按照先低倍镜视野后油镜观察的步骤，分别用双目普通显微镜及大众世纪dz-510多媒体显微成像仪进行骨髓细胞形态学分析。
2 结果
2.1屏幕图像与镜下视野基本形态无异
通过与普通光学显微镜下的视野进行对比观察，多媒体显微成像分析系统可以清晰无损实时的显示图像，与镜下观察的视野基本形态无异，只是放大倍数增大。
2.2屏幕图像比普通显微镜下的更加生动化化、清晰化
通过采集装置（数码ccd摄像头）获取的图像更加生动、形象、直观、动态的反映在显示器上，使检测者更方便、清晰地观察、诊断采集图像，甚至在高放大倍率的条件下，能看到在普通光学显微镜下难以观察或观察不到的图像。
2.3能更快速、更准确的观察骨髓片及外周血涂片
普通光学显微镜因受其放大倍率的限制，致使对骨髓涂片难于作出快速、准确的判断分析。多媒体显微成像技术中的屏幕图像更易于观察，比镜下目视更方便、更快捷，而且更有利于多人对血液病进行共同分析判断。
2.4对疑似患有血液病患者的骨髓涂片进行存储、管理、传输
多媒体显微成像分析系统不但能进行屏幕图像观察，更弥补了普通光学显微镜所不具有的存储、管理、传输功能。它既可以建立大容量静态图片库，可以无限保存采集下来的骨髓涂片和外周血涂片诊断结果，也可以通过图像存档与传输系统与医院信息系统、个人健康档案等联网，实现复杂的查询和全方位的统计，实现网络远距离传输，进行及时的会诊和诊断疾病
2.5多媒体显微成像技术的应用缓解了检验工作者的眼疲劳
作为检验工作者，首先，持续的镜下目视工作，易使睫状肌和眼外肌处于高度紧张状态，导致睫状肌痉挛，调节不能放松，引起眼干、眼涩、眼酸胀，视物模糊甚至视力下降，还会引发和加重各种眼病；再者，神经高度紧张会使眼睛发胀，视神经功能慢性减退，直接影响着检验工作者的工作与生活。屏幕图像的直观化、清晰化解决了普通显微镜难以观察或观察不到的现象，不但提高急性白血病的正确分型，更缓解了检验工作者在繁杂工作中的眼疲劳。
3 讨论
白血病是造血干细胞克隆性疾病，是一组高度异质性的恶性白血病，严重威胁着人们的身体健康。急性白血病因分型不同，采用的治疗方案也不同，疗效和预后也不同[1]。急性白血病的诊断除依据临床症状体征与血象外，骨髓细胞形态学检验是诊断急性白血病的主要依据和必要检查。但是由于多种原因，导致白血病漏诊、误诊的现象时有发生。因此本文通过多媒体显微成像技术在骨髓细胞学检验中的应用，提高急性白血病的正确分型，从而更好的为白血病的诊断、确定治疗方案、判断预后、观察疗效服务。
1 对象与方法
1.1对象：选取56例临床患者的骨髓片及外周血涂片进行观察。器材：大众世纪DZ-510多媒体显微成像仪；XSP-2CA双目普通显微镜;瑞氏-姬姆萨复合染液；玻片等。
1.2 方法：（1）骨髓涂片：取有骨髓小粒部分，制备厚薄适宜、染色良好的骨髓涂片，同时做外周血涂片。（2）染色：采用瑞氏-姬姆萨复合染液进行骨髓涂片染色。（3）显微镜检查：严格按照先低倍镜视野后油镜观察的步骤，分别用双目普通显微镜及大众世纪DZ-510多媒体显微成像仪进行骨髓细胞形态学分析。
2 结果
2.1屏幕图像与镜下视野基本形态无异
通过与普通光学显微镜下的视野进行对比观察，多媒体显微成像分析系统可以清晰无损实时的显示图像，与镜下观察的视野基本形态无异，只是放大倍数增大。
2.2屏幕图像比普通显微镜下的更加生动化化、清晰化
通过采集装置（数码CCD摄像头）获取的图像更加生动、形象、直观、动态的反映在显示器上，使检测者更方便、清晰地观察、诊断采集图像，甚至在高放大倍率的条件下，能看到在普通光学显微镜下难以观察或观察不到的图像。
2.3能更快速、更准确的观察骨髓片及外周血涂片
普通光学显微镜因受其放大倍率的限制，致使对骨髓涂片难于作出快速、准确的判断分析。多媒体显微成像技术中的屏幕图像更易于观察，比镜下目视更方便、更快捷，而且更有利于多人对血液病进行共同分析判断。
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2.4对疑似患有血液病患者的骨髓涂片进行存储、管理、传输
多媒体显微成像分析系统不但能进行屏幕图像观察，更弥补了普通光学显微镜所不具有的存储、管理、传输功能。它既可以建立大容量静态图片库，可以无限保存采集下来的骨髓涂片和外周血涂片诊断结果，也可以通过图像存档与传输系统与医院信息系统、个人健康档案等联网，实现复杂的查询和全方位的统计，实现网络远距离传输，进行及时的会诊和诊断疾病
2.5多媒体显微成像技术的应用缓解了检验工作者的眼疲劳
作为检验工作者，首先，持续的镜下目视工作，易使睫状肌和眼外肌处于高度紧张状态，导致睫状肌痉挛，调节不能放松，引起眼干、眼涩、眼酸胀，视物模糊甚至视力下降，还会引发和加重各种眼病；再者，神经高度紧张会使眼睛发胀，视神经功能慢性减退，直接影响着检验工作者的工作与生活。屏幕图像的直观化、清晰化解决了普通显微镜难以观察或观察不到的现象，不但提高急性白血病的正确分型，更缓解了检验工作者在繁杂工作中的眼疲劳。
3 讨论
一半是技术，一半是生物
马炯1999年进入复旦大学物理系，2008年取得物理系光学专业博士学位。博士阶段开始，马炯就致力于发展光学技术与生物课题相结合的研究工作。期间他曾作为访问学者前往南非罗德斯大学化学系和挪威奥斯陆大学生理系进行学术交流。
在南非期间，他确认水溶性CdTe量子点的光催灭机理，首次测定其单态氧产量，并开创出一种应用于其实现光动力治疗癌症的方法。2008年赴美从事博士后工作后，他一直致力于发展新型的单分子超分辨荧光显微镜，用于细胞核孔复合物的研究工作。在美国，马炯与Yang教授共同开发了SPEED显微技术，并在10nm空间精度和400μs时间精度下，研究了各类分子穿越细胞核孔的选择机制。他首次观测到细胞核孔内非折叠蛋白的三维结构，并首次获得生物小分子穿越细胞核孔三维路径，确定了其间的选择性机制，并于2010年及2012年在Proceedings of the National Academy of Sciences上发表了两篇高质量论文。
马炯还与Walter教授合作，开发应用于超分辨显微镜的mRNA荧光标记系统，结合单分子显微追踪技术，完成了mRNA穿越核孔的选择机制的初步研究，确认了mRNA核孔输出三维路径，纠正了一维路径数据所造成的认知误解，并发表在Nature Communication上。
而谈到技术和生物研究，马炯说他从来没有纠结两者之间的取舍，而是始终游走在两者的平衡之中。曾经在南非和挪威做访问学者的时候，他感到技术上偏重太多时，就在前去美国的时候有意识地加重了生物研究的选择。技术是他的“技”，而生物就是他的“巧”。有技方成巧，通过超分辨率光学显微镜的技术不断提高，他在细胞核孔复合物领域的研究也不断加深；以巧推动技，通过细胞核孔复合物实验研究的需求，他又不断革新超分辨光学显微镜的技术。双子的多面性，他展现在了科研领域中，并且大获成功。
2015年6月，马炯归国。他坦言，归国的一部分原因是因为故乡的父母，另一部分则是国家现在对于青年学者的重视，能够让他在最有精力的时刻投入到科研中去。“能够为国家做一点事情，国家也重视我做的事情，这当然是再好不过了。”马炯笑言。
超分辨光学显微镜下看世界
显微镜的发展满足了人们对观察微观世界的需求，让人们可以看得越来越“小”。但由于衍射极限的存在，几十年来光学显微镜的分辨率停滞在了200nm左右。2014年诺贝尔化学奖颁发给了美国及德国三位科学家Eric Betzig、Stefan W. Hell和William E. Moerner，获奖理由是“研制出超分辨率荧光显微镜”。几位获奖者巧妙设计了避开衍射极限的方法，其研究突破性地将光学显微镜带入了纳米维度。在纳米显微镜下，科学家实现了活体细胞中单个分子通路的可视化，能够观察到分子是如何在大脑神经细胞之间生成神经突触；可以追踪帕金森病、阿尔兹海默症和亨廷顿症患者体内相关蛋白的累积情况；还能跟踪受精卵在分裂形成胚胎时蛋白质的变化过程。现在已经进入了“光学显微镜2.0”的时代，超分辨荧光显微镜推动着新一轮生物医学的飞速发展。
现今，已具有多种不同超分辨成像技术实际应用于生物系统的范例，也已出现了商业化的超分辨显微镜系统，但仍然没有达到完美状态。在许多生物研究中，各类超分辨系统有着各自的局限性，如对于特殊荧光标记的发光特性依赖，或是高空间精度测量制约了探测时间进一步缩短。因此，研究和发展合适新的原理和方法，研制出适合专项生物课题研究的显微镜将是今后发展的一大方向。
谈起二维到三维的超分辨退卷积计算开发的时候，马炯说起了一个有意思的故事：他做出这个开发之后，花了整整一个星期的时间说服他的老师来相信他的成果，因为他的老师根本无法想象有人可以做出从二维分布中获取系统的三维分布的开发。而当他的老师认可了他的成果，他和他的老师又开始一起说服领域里的其他研究者一起应用这项成果的相关研究人员。“这告诉我们，固化思维的可怕。科技要进步，科研人员要创新研究，首先就要从打破自己的固有传统认知开始。”马炯严肃地说。
归国后的马炯将开始着手建立显微镜第二平台荧光返还探测技术，实现兼具超高的时间和空间分辨率的三维分子荧光追踪系统。他将把研究中所获得的信息将与跟踪RNA输出细胞核孔的研究互相印证，通过分析RNA在细胞核孔各位置的高时空精度动态过程，进一步研究细胞核孔蛋白调控基因的机理。此外，研究中所发展的原理和方法还将能够被广泛用于毫秒量级甚至更快的纤毛内分子运输、细胞间分子交换及跨膜通道开关等生物问题的研究。
在研究中，马炯将采用创新技术，促使实验系统同时具有很高的时间和三维空间分辨率，在不影响平面二维光学分辨精度的前提下，不通过拟合点扩散函数，而在亚毫秒级时间分辨量级和10nm三维空间分辨量级，实现对三维单分子荧光信息的实时探测和分析，满足高速动态生物学研究的特点和条件。在新型光学系统中，他还将利用凹面镜返还光程无色差的光学原理，创新设计凹面镜荧光返还光路系统，能够将z方向信息转换成x-y水平方向的信息，从而获取单分子z方向的位置信息。
细胞核孔复合物探寻
在细胞核孔复合物的研究中，马炯将利用SPEED显微镜技术，完成各类FG屏障与各类主要的传输分子间反应区域的三维分布测量。细胞核孔复合物是真核细胞中连接细胞质和细胞核之间的选择性双向通道，控制着绝大部分细胞核所需的蛋白输入，以及核内基因物质的输出。可以说，核孔是细胞内基因调控中非常重要的一个环节。核孔的缺陷会导致核孔相关的白血病及阿尔兹海默症等疾病。其本身更是各类病毒侵入细胞的重要关口之一，各类病毒会通过不同的方式通过核孔，最终侵入细胞的基因表达系统导致疾病发生。核孔的结构与功能的研究将为各类基因调控机制的研究提供一环重要的依据，对核孔蛋白缺失相关的白血病、阿尔兹海默症的致病机制，以及各种类病毒的侵入机制等核孔相关病理机制或基因治疗提供关键信息。
一个NPC是由30种多不同的核孔蛋白构成，长约200nm、直径为120nm、中心内径为50nm的大分子复合物。其中有三分之一的核孔蛋白富含苯丙氨酸-甘氨酸（FG）氨基酸片段，且在自然状态下呈现出非固定形态，我们称之为FG-Nups。这些FG-Nups组成了具有选择性机制的FG屏障。FG屏障选择性地调控基因相关物质按照被动运输或者主动介入运输的方式进出细胞核：只有小于60kDa的分子才能通过被动运输的方式，自由扩散通过NPC；另一种方式是主动运输，如含有入核信号或者核孔输出信号的蛋白或复合物分子，在核孔运输蛋白帮助下，形成复合物，通过TRs与FG片段相互作用，从而通过FG屏障。TRs与需要传输的蛋白形成的复合物的结合与解离，通过细胞核内外的RanGDP和RanGTP的浓度梯度来调节。通过电子显微镜可以观察到细胞核孔结构蛋白，但却无法获得这些高度自由的非折叠蛋白的结构，所以至今在生理状态下FG屏障及其相关的核孔物质传输的机理仍不清楚。
马炯将利用SPEED显微镜技术，完成各类FG屏障与各类主要的传输分子间反应区域的三维分布测量。他将确认活细胞内FG-Nup相互反应的存在及相应的水凝胶分布。综合各反应分布，完成接近完善的FG屏障的完整分布。他还将利用基因敲除，获取缺失核孔蛋白的分布，理解其对白血病的致病机理及对腺相关病毒（AAV）基因疗法的调控机制。从传输蛋白间的竞争情况，了解细胞核孔在大通量物质运输下对应的优先选择机制。
达成这项研究的基础，是SPEED显微技术能在超短的时间内获得高精度的空间位置信息，调控光学设置的稳定和准确，以及对各不同分子不同扩散速率下，在确保单分子荧光定位精度的同时，优化实验条件获取最多的数据量，是实验成功的关键。拥有丰富的超分辨光学经验，这让马炯能够满足数据的准确性及稳定地产出量。据此，他将创新领先技术，努力实现分子竞争通过核孔的实验设计创新。
未来故事
回国后的马炯选择了他的母校复旦大学作为科研工作的新起点。这里熟悉的环境让他很快就进入到了工作当中并规划新的征程。
首先，马炯将继续提升SPEED显微技术的性能及推广其应用范围。所有的对称体系研究中，马炯的SPEED显微技术都可以推广应用。而在快速跟踪领域中，这项技术也具有明显优势。其次，他将继续完善超快速的实时单分子三维追踪。再次，马炯将提高静态单分子荧光定位下的超分辨图像精度。现在的主流超分辨显微镜是用了一种光开关蛋白来实现，这将会造成单位时间内的信号光的损失。马炯换了其他方式，利用分子运动进特定区域时将这个分子可能发出的所有荧光进行收集，从而提高静态单分子荧光定位下的超分辨图像精度。
